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大鼠模型试验:玻璃体腔内注射伊马替尼安全剂量和其对激光诱导的脉络膜新生血管作用

2016年09月26日 浏览量: 评论(0) 来源:International Journal of Retina and Vitreous December 2015, 1:16 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:甲磺酸伊马替尼是一种酪氨酸激酶的特异性抑制剂,在2001被批准用于治疗人类癌症。它能抑制PDGFR信号转导。进行两个阶段的实验研究确定玻璃体腔内注射伊马替尼(IVI)的最大安全剂量和对大鼠脉络膜新生血管(CNV)的抑制作用。
摘要:背景:进行两个阶段的实验研究确定玻璃体腔内注射伊马替尼(IVI)的最大安全剂量和对大鼠脉络膜新生血管(CNV)的抑制作用。
 
方法:第一个阶段实验,60只大鼠随机分为六组(A到F),五组动物接受IVI的浓度分别为330(A)、250(B)、165(C)、80(D),和40(E)ug/ 5uL,对照组接收平衡盐溶液(BSS)。除了视网膜电图外,也做了常规的病理分析、胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学。第二阶段实验,对25只大鼠激光光凝诱导CNV,将动物随机分为两组。一组接受在第一阶段确定的IVI的最大安全剂量,另一组均注射BSS。4周后,对两组进行荧光素眼底血管造影荧光素渗漏平均得分和平均CNV区域病理切片比较。
 
结果:第一阶段实验,ERG显示视网膜毒性为A-D组,而组织病理学显示视网膜毒性为A-C组,因此,40 ug / 5uL的伊马替尼被指定为第二阶段的最大安全剂量。第二阶段实验,晚期荧光素渗漏和CNV面积在伊马替尼治疗眼和对照组之间无显著差异。
 
结论:尽管使用40ug/ 5uL IVI的安全剂量对激光诱导的CNV无抑制作用。需要进一步的研究来调查伊马替尼同传统抗CNV药物的协同作用。
 
关键词:伊马替尼 脉络膜新生血管  血小板衍生生长因子 大鼠荧光素血管造影
 
背景:年龄相关性黄斑变性(AMD)是在65以上,最常见的致盲原因。血管内皮生长因子(VEGF)是在生理和病理血管生成的最重要的细胞因子,导致脉络膜新生血管(CNV)。因此,抗血管内皮生长因子药物是抗血管生成治疗的支柱。血小板衍生生长因子(PDGF)参与血管生成的第二重要的细胞因子,促进招聘细胞、平滑肌细胞是血管成熟和稳定必不可少的因素。PDGF家族结合不同的受体,称为血小板衍生生长因子α和β受体。PDGF受体(PDGFR)是酪氨酸激酶受体,内皮细胞和血管平滑肌细胞中更广泛的的表达PDGFR-β。酪氨酸激酶是重要的细胞信号蛋白。多个酪氨酸激酶参与血管生成,包括酪氨酸激酶受体如VEGF和PDGF受体。受体酪氨酸激酶是细胞外信号进入细胞的关键。一些受体酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼,西地尼布,舒尼替尼、帕唑帕尼最近被批准应用。这些药物,通过抑制VEGF和PDGF信号,有望成为CNV治疗的新方法。
 
甲磺酸伊马替尼是一种酪氨酸激酶的特异性抑制剂,在2001被批准用于治疗人类癌症。它能抑制PDGFR信号转导。在受体信号的情况下,血管周细胞剥离、血管壁的完整性受到损害。血管变得更加敏感,提取血管内皮生长因子,血管衰退变得更为突出。假设伊马替尼能抑制或至少减缓CNV的进展。在第一阶段,在大鼠模型中确定了玻璃体腔注射伊马替尼的最大安全剂量,在第二阶段,在大鼠模型研究了玻璃体腔伊马替尼治疗CNV的可能的抑制作用。
 
方法:实验设计和动物:研究的目的I期是确定玻璃体腔内注射伊马替尼(IVI)的最大安全剂量和II期确定其可能对CNV动物模型的抑制作用。85只大鼠,体重200-300g。实验猴动物通过肌肉注射氯胺酮麻醉(80mg/kg)和盐酸甲苯噻嗪((5mg/kg)安乐死。一滴0.5%托吡卡胺扩张瞳孔,在I期ERG和和II期荧光素眼底血管造影后,深度麻醉情况下颈椎脱臼法处死大鼠。
 
玻璃体腔内注射伊马替尼的制备:伊马替尼仅有100和400mg片剂,并没有任何可注射药剂。药物的活性物质是甲磺酸伊马替尼的形式。甲磺酸伊马替尼在水溶液中的溶解度取决于溶液的pH值和最高的溶解度时pH为5.5-5.8。无菌蒸馏水制备甲磺酸伊马替尼达到pH 5.5-5.8的解决方案是使用少量的硫酸。添加甲磺酸伊马替尼后,最终溶液的pH值为中性。制备40,80,165,250和330u g / 5uL浓度伊马替尼。
 
第一阶段实验:六十只大鼠随机分为六组(A到F);其中五组动物右眼接受IVI浓度分别为330(A)、250(B)、165(C)、80(D),和40(E)ug/ 5ul,对照组(F)接受平衡盐溶液(BSS)。注射是在无菌条件下使用手术显微镜进行的,然后在注射后1周和4周,进行视网膜电图(ERG)检查。4周后,处死大鼠,其右眼被摘除进行组织病理学分析。基于ERG和光镜检查结果的基础上,确定第二阶段实验的IVI最大安全剂量。
 
视网膜电图(ERG):实验前获得视网膜电图基线值,在注射伊马替尼后1周和4周获得视网膜电图。所有的程序都在黑暗中用红外线照明和图像转换器。简而言之,至少2小时的暗适应后,动物麻醉散瞳。在麻醉期间体温维持在36和37°C之间,然后将动物放置在记录室中一个温度控制的加热垫上。记录ERG信号,实施角膜金丝电极。采用RETI-port /扫描21电生理诊断系统记录ERG信号。同时记录双眼明视、暗视反应。化如果ERG b波振幅变至少从基线值下降30%被认为是重要的。在不同时间点记录ERG结果,并对组间数据进行比较。
 
组织病理学和免疫组织化学检查:ERG记录后,将动物处死,摘除眼球10%福尔马林固定,5?M组织切片后HE染色光镜下检查。观察视网膜层的完整性和视网膜出血,炎症和萎缩。此外,进行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化研究(多克隆抗胶质纤维酸性蛋白、)组没有任何病理变化。与对照组相比,治疗组视网膜Muller细胞明显增加GFAP免疫反应。组织病理学变化表明视网膜毒性包括:视网膜层不完整性,视网膜出血的存在,和/或炎症、视网膜神经胶质增生或萎缩的存在和GFAP免疫反应存在显著。
 
第二阶段实验:25只实验性诱发CNV大鼠,分两组,治疗组(14只),右眼玻璃体腔注射第一阶段确定的IVI最大安全剂量,对照组(11只)接受玻璃体腔注射BSS。4周后,动物进行荧光素眼底血管造影(FAG),然后实施安乐死。CNV区域进行组织病理学检查评估。
 
激光诱导脉络膜新生血管:用大鼠作为激光诱导的CNV动物模型,因为大鼠视网膜同人类视网膜非常相似,着色均匀,光凝后表现出较高的CNV。大鼠麻醉,扩大瞳孔,各眼各主要血管之间应用狭缝灯红外二极管激光传输系统,非接触式78 D镜头,六激光点(波长810 nm;光斑大小,100um;持续时间0.1 s;和功率,150毫瓦)诱导CNV。每一个激光点出现蒸汽气泡预示布玻璃膜的破裂。
 
荧光素眼底血管造影:激光光凝后四周,进行荧光素眼底血管造影(FAG),在全麻的状态下腹腔注射0.1ml 10%荧光素钠后进行血管造影,视网膜专家对图片进行解释,对晚期强荧光血管造影存在病变分级为:0,无泄漏;1,轻微的泄漏;2,中度泄漏;3、突出的泄漏。
 
组织病理学切片中脉络膜新生血管区的测量:福尔马林固定眼睛,嵌入石蜡块后,制备薄层切片,苏木精-伊红染色。对CNV病变区连续切片,光镜下观察。使用数码相机拍摄最大的CNV。图像转移到计算机和CNV面积划定并使用ImageJ软件计算。
 
结果:第一实验阶段:A、C、F中一只大鼠死亡、D组2只大鼠死亡,E组3只动物死亡,被研究排除。
 
视网膜电图:IVI给药1、4周后,暗适应和明适应的ERG平均振幅,所有组的ERG模式几乎相同。组与组之间,每组在指定的时间点观察的明视ERG结果无显著差异。IVI给药 4周后,暗视ERG的b波平均振幅在A组到D组明显减少,E组和F组没有显著变化。
 
光学显微镜:组织病理学分析显示,A到C组视网膜毒性的变化视网膜层完整性和视网膜萎缩性改变的形式。D、E组GFAP免疫反应的组织病理学特征与对照组相比不显著。由ERG及病理结果显示:40ug/ 5uL为II期IVI的最大安全剂量。
 
第二阶段实验:25只大鼠,治疗组3只,对照组1只被最终评价排除。
 
荧光素血管造影评价脉络膜新生血管:激光应用四周后,FAG激光烧焦的点显示CNV的发展。伊马替尼注入的眼睛的平均得分与对照组没有显著差异。
 
组织病理学切片中的脉络膜新生血管区:IVI处理的大鼠同对照组相比,脉络膜新生血管区无明显差异,这一发现与FAG的结果是一致的。
 
讨论:在第一阶段的研究中,40ug/ 5uL IVI被确定为最大安全剂量。为评估兔眼内IVI毒性,kitzmann等人发现在剂量为1.65mg/ 0.1ml伊马替尼能引起家兔广泛的视网膜组织学毒性,而在较低剂量825ug/ 0.1ml和165ug/ 0.1ml时,未见明显毒性反应。
 
结论:玻璃体腔内注射伊马替尼40ug/ 5uL为最大安全剂量,对模型大鼠CNV无抑制作用。然而,伊马替尼可能在CNV的治疗对常规抗VEGF药物有协同作用,还需要进一步的研究。
 
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