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小鼠脑型疟疾模型: trioxaquine的疗效及安全性评价

2017年11月07日 浏览量: 评论(0) 来源:Malaria JournalDecember 2017, 16:268 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:恶性疟原虫多药耐药株的出现造成脑和其他形式严重疟疾感染死亡人数的增加,其中青蒿琥酯单药治疗是目前的首选药物。本研究旨在通过小鼠脑疟疾模型探讨是否青蒿琥酯同4,7-二氯喹啉共价键连接的化合物trioxaquine能提高脑疟疾感染的疗效。

摘要:恶性疟原虫多药耐药株的出现造成脑和其他形式严重疟疾感染死亡人数的增加,其中青蒿琥酯单药治疗是目前的首选药物。本研究旨在通过小鼠脑疟疾模型探讨是否青蒿琥酯同4,7-二氯喹啉共价键连接的化合物trioxaquine能提高脑疟疾感染的疗效。

方法:人脑型疟疾动物模型C57BL / 6雄性小鼠,腹腔注射(ip)感染伯氏疟原虫。从感染后第8天分别静脉注射(IV)12.5 和 25 mg/kg的trioxaquine 治疗,每日2次,连续3天。与trioxaquine预处理(青蒿琥酯和4,7-二氯喹啉),奎宁也被列为对照组。trioxaquine体内的安全性评价采用雌性瑞士白化小鼠口服给药300或2000 毫克/公斤监测症状的严重程度及治疗后14 天观察死亡率。

结果:trioxaquine两剂量在用药后24h能有效和快速清除寄生虫,抗疟原虫的活性达到80%。长期的寄生虫监测显示清除寄生虫的小鼠存活超过60 d,观察无复发。青蒿琥酯治疗感染的小鼠8天后复发 。4,7-二氯喹啉和奎宁治疗组寄生虫感染的动物,没有表现出任何显著寄生虫抑制作用。

结论:共价结合治疗被证明是一个迫切需要新的对抗脑型疟疾的抗疟药方法。其复杂的药理功效能保护青蒿琥脂对抗疟原虫,病改善疟疾感染的临床结果。

关键词:共价结合疗法  脑型疟疾 药理  trioxaquine

背景:尽管经过多年的研究在疟疾防治方面取得了巨大的进展,脑型疟疾(CM)仍然是恶性疟原虫最可怕的严重并发症。 5 岁儿童是最容易受影响的,具有惊人的90%的死亡率。没有有效的疟疾疫苗,化疗仍然是 疟疾治疗的主要方式。几十年来,奎宁一直是CM治疗的首选药物。由于对喹啉类药物如氯喹(CQ)的耐药性的担忧促使WHO改变政策,使用以青蒿素为基础的药物,如青蒿素和青蒿琥酯。同肌肉注射蒿甲醚相比较,选择了注射青蒿琥酯由于其优越的疗效和预后生存。尽管青蒿琥酯进行了有效的CM化疗,但治疗组患儿的死亡率仍然高达15 - 25%,而那些存活于CM急性发作期的患者则会遭受包括癫痫在内的长期神经后遗症。在撒哈拉沙漠以南的非洲地区,恶性疟原虫中最致命的病原体是恶性疟原虫,导致了疟疾相关90%的死亡,显示出多重耐药性。目前,青蒿素 (ART)衍生品结合使用更长的持续时间的抗疟疾药物青蒿素为基础的联合疗法(ACT)的策略,以保护他们免受抵抗。不幸的是青蒿素常被用来作为单一的药物进行治疗。经过漫长而艰难的搜索,开发有效的、便宜的和急需的抗疟疾药物,许多研究小组采用了新兴的策略在药物化学中称为杂交或共价结合疗法。这是一个基于药物的药效基团共价连接到一个单一的杂交分子的合理药物设计的方法,称为混合药物。结果表明,这种混合药物对单独的前体或其共同制剂具有更高的疗效。这种方法降低了治疗失败的风险,也对合作的药物或药物提供电阻保护,被认为是更便宜,因为只有活性基团共价连接,从而避免了长期、艰苦的和昂贵的前共同制定个体药物开发程序。

方法:寄生虫、宿主和药物: 伯氏疟原虫(ANKA株)被用于研究,其被冻存在肯尼亚医学研究院的-80度冰箱中。解冻恢复后通过腹腔注射接种到雄性瑞士白化大鼠上。C57BL / 6雄性小鼠作为寄生虫受体体重25 ± 2 g,作为CM小鼠模型。模型鼠被分配饲养,每笼5只,自由采食和饮水。试验药物,即青蒿琥酯、4,7-二氯喹啉、奎宁从西格玛公司购买,而trioxaquine,一种4,7-二氯喹啉连接到连接器并耦合青蒿琥脂的混合药物。青蒿琥酯,4,7-二氯喹啉和trioxaquine溶解在70%吐温-80溶液(D = 1.08 克/毫升)和30%乙醇(D = 0.81 克/毫升)在最后稀释浓度吐温-80和乙醇分别为7%(V/V)和3%(V / V)。奎宁溶于生理盐水中。

实验小鼠感染:供体小鼠被麻醉和受感染的红细胞收集使用肝素化注射器通过心脏穿刺。寄生虫感染数量用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整。雄性C57BL/6小鼠腹腔接种0.2 ml约1 × 105寄生的红细胞(pRBCs)。然后将受感染的小鼠随机分成五组,观察实验性脑疟疾(ECM)的症状,包括粗毛、肢体瘫痪、共济失调、抽搐和昏迷。在C57BL/6,ECM的迹象通常发生在腹腔接种后6天和9天。薄血涂片 Giemsa染色进行光镜下观察(×1000)确定感染。

啮齿类脑型疟疾动物模型体内评估trioxaquine效果:药物治疗开始时,感染的小鼠有明显标志的脑型疟疾。基于对4天抑制试验的结果用来评估trioxaquine,(剂量12.5和25 毫克/公斤通过尾静脉注射(IV)每日2次,连续8天)的体内化学抑制效果。三组阳性对照组也同样采用青蒿琥酯(12.5 毫克/公斤),奎宁(60 毫克/公斤),与4,7-二氯喹啉(12.5 毫克/公斤)治疗。一个阴性对照组只接受了药物赋形剂。制备小鼠尾血薄血涂片姬姆萨染色后通过显微镜检查测定各鼠体寄生虫情况。血涂片分别在治疗后24h和48h制备。每只小鼠血片寄生虫计数使用微软Excel处理。确定寄生虫抑制百分比。在治疗3天后对小鼠存活监测长达60天。所有的红细胞计数和寄生虫水平表示为平均值±标准偏差和寄生虫数采用单因素方差分析处理。

小鼠血脑屏障完整性的评价:在第8天实验动物表现出明显的脑疟体征,C57BL/6小鼠静脉注射200 μL 2%(W/V)伊万斯蓝染料。1h后处死动物,获取脑组织通过染料和图像记录评估大脑染色的程度。此方法的原理是基于染料和血浆白蛋白之间键的形成,如果脑血管由于血脑屏障的损害而渗漏,那么染料-蛋白质复合体就迁移到组织中,形成肉眼可见的蓝色。

Trioxaquine安全性评价:使用雌性未感染的动物,以死亡或严重症状作为观察对象进行评估。使用两到四种剂量在5, 50, 300和2000 毫克/公斤的范围内急性口服测试化合物的毒性。使用两种剂量300和2000  毫克/公斤,从低剂量开始测试。瑞士白化雌性小鼠体重20 ± 2g,动物第一次禁食4 h之后口服上述剂量。对测试化合物的毒性症状持续时间和严重程度,如皮肤和皮毛,改变眼睛、粘膜、震颤、抽搐、流涎、腹泻、昏迷,甚至死亡 进行监测。从给药后30min、4h、24h直到药后14天持续观察。

动物福利:所有动物实验结束后,腹腔注射150 mg/kg戊巴比妥钠溶液处死动物,并放入标有生物危害的垃圾袋中,等待焚烧处置。

结果:trioxaquine疗效评价:治疗开始于第8天,实验动物被明确诊断为ECM或至少有一个或两个ECM动物模型公认的信号,包括神经紊乱,如共济失调,粗毛,四肢麻痹等。每种测试药物在治疗后24h的寄生虫清除率被记录在表一。寄生虫数量连续被监测60天。两剂量12.5和25 毫克/公斤IV的 trioxaquine表现出强大的和有前途的抗疟原虫功效。24 h后12.5 毫克/公斤trioxaquine,寄生虫数从11.7下降到1.6(86.6%清除率),25 毫克/公斤trioxaquine寄生虫数从11.7下降到0.4(96.4%清除率)48 h后显微镜下观察不到寄生虫。青蒿素喹唑啉混合药物在两种剂量下表现出强大的抗疟活性,从而迅速清除寄生虫。 治疗后动物存活60天,除了一只12.5 毫克/公斤治疗组动物,其死亡时未监测出寄生虫。 12.5 毫克/公斤青蒿琥酯治疗24h后也呈现出快速寄生虫清除率84.8%,48 h后显微镜下没有观察到寄生虫。然而,治疗后8天观察到的所有动物又再次复发感染。60 毫克/千克奎宁和12.5毫克/公斤4,7-二氯喹啉治疗后24h没有显示出任何显著寄生虫减少,所有实验组动物分别于第12天和第7天死亡。奎宁组在治疗后48h显示有显著的寄生虫清除率(44.9%),但是随后又监测到寄生虫复发,最终导致动物死亡。对照组动物于感染后第10天死亡。

小鼠血脑屏障完整性评价:血脑屏障(BBB)的损害已被认为是CM的病理生理机制之一,因为漏血脑屏障会使有毒或有害的化合物进入大脑,导致神经功能障碍。在第8天未注射2%伊万斯蓝染料的受感染动物脑组织观察显示美白程度较高。未受感染的C57BL/6小鼠表现为正常的正常脑,血供正常,伊万斯染色表明BBB完整性。受感染实验动物后第8天用2%伊万斯蓝染料注射观察脑组织显示小鼠脑组织染色程度更高。对感染的C57BL/6小鼠60 天治疗后表现出完全恢复脑图像的观察,正常的血液供应,由伊万斯蓝染料染色缺乏大脑染色。

小鼠对trioxaquine的安全性评价:利用未受感染的雌性小鼠禁食4h后进行trioxaquine急性口服毒性,给予口服300和2000 毫克/公斤剂量。测试动物连续观察,对症状的严重程度进行评估。所有的动物都没有显示出任何严重或毒性标志,皮肤和毛皮没有变化,没有观察到眼睛和粘膜,以及呼吸活动异常;也没有震颤、抽搐、流涎、腹泻、睡眠和昏迷观察。2000mg/kg剂量小鼠给药后14天存活率为67%。表明这种化合物毒性较弱。

结论:在所建立的感染试验得到的trioxaquine体内结果显著,以及治疗后的生存率数据清楚地表明,共价结合治疗是治疗CM未来抗疟疾药物发展的可行策略。小鼠治疗指数(TI)值为400以上,这种药物的安全性令人鼓舞,这并不奇怪,因为前体是已经用于临床的药物的一部分。因而,trioxaquine作为治疗CM的候选药物能观察到良好的安全性。

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