RSS订阅

动物模型

您现在的位置:首页>研究进展>动物模型

腺相关病毒载体在激光诱导脉络膜新生血管小鼠模型中的转导模式

2018年07月03日 浏览量: 评论(0) 来源:Molecular Therapy - Methods & Clinical Development Volume 9, 15 June 2018, Pages 90-98 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:腺相关病毒(AAV)载体是一种很有前景的眼科基因治疗平台。近年来,报道了湿式老年性黄斑变性治疗脉络膜新生血管(CNV)的成功经验。然而,由于视网膜的病理条件可能改变病毒载体的取向,因此有必要用CNVs评估不同血清型AAV载体在视网膜中的转导效率。这里,我们展示了AAV2,5,和8载体在激光诱导的CNV小鼠模型中转导的模式和效能。
背景:腺相关病毒(AAV)载体是一种很有前景的眼科基因治疗平台。近年来,报道了湿式老年性黄斑变性治疗脉络膜新生血管(CNV)的成功经验。然而,由于视网膜的病理条件可能改变病毒载体的取向,因此有必要用CNVs评估不同血清型AAV载体在视网膜中的转导效率。这里,我们展示了AAV2,5,和8载体在激光诱导的CNV小鼠模型中转导的模式和效能。在玻璃体内注射AAV2、- 5和-8表达EGFP前5天,C57BL/6J小鼠在右眼上进行单侧激光光凝诱导CNV。在所有的AAV衣壳类型中,CNV病变周围的转导增加,AAV2导致最高的转导效率。在没有CNV的情况下,AAV2载体转导神经节和内核层(INL)细胞,AAV5和AAV8仅在视网膜神经节细胞层中转导少量的细胞。CNV增加AAV2载体在视网膜和CNV周围的表达,转导的细胞包括视网膜神经节细胞、Mü勒细胞、来自INL和外核层(ONL)的细胞、感光细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞。AAV2还转导CNVs中的炎性细胞和内皮细胞。AAV5和AAV8在视网膜神经节、Müller、INL、ONL和RPE细胞中以局部模式转导,仅CNV病变表面的内皮细胞显示EGFP表达。综上所述,CNV的形成增强了AAV2、-5和-8的转导,AAV2在CNV病变细胞中的转导效率最高。
 
关键词:腺相关病毒  脉络膜新生血管  年龄相关性黄斑变性  基因治疗
 
简介:腺相关病毒(AAV)是目前广泛应用的基因治疗眼用病毒载体之一。AAV载体是最有前途的基因治疗递送方法,几种血清型可通过玻璃体内注射或视网膜下注射将基因转导到组织神经视网膜的特定细胞类型中。例如,玻璃体内注射AAV2导致视网膜神经节细胞的转导,视网膜下给药AAV8导致感光细胞的转导。在眼基因治疗时代开始,建立了脉络膜视网膜组织AAV血清型的取向,最近的研究表明,某些疾病可以提高特异性AAV血清型的转导效率。因此,必须确定最佳的AAV血清型和给药途径来治疗不同的视网膜疾病以最大化治疗效果。近年来,新生血管AMD(NAMD)作为眼部基因治疗的一种可能的候选物受到了广泛的关注。玻璃体内注射抗血管内皮生长因子(VEGF)药物目前被认为是NAMD的最佳治疗方法。然而,每月治疗的经济负担和抗VEGF治疗的耐药性是NAMD治疗中的问题。需要开发新的治疗方法。我们最近证明,AAV介导的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通过shRNA增加自噬和抑制脉络膜新生血管(CNV),暗示NAMD基因治疗的潜力。玻璃体内给药AAV2导致CD31 +细胞在CNV病变中的转导。只有AAV2在该研究中得到评价。当考虑细胞特异性治疗效果,如自噬时,应确定导致靶视网膜细胞转导效率最高的病毒取向。在这项研究中,我们研究了三种常用AAV血清型,AAV2,5,和8的转导效果。此外,我们研究了三种AAV血清型转导各种视网膜细胞类型的能力。
 
动物:45只雄性C57BL/6J小鼠,,8周龄,镇静和麻醉,腹腔注射40 mg/kg唑拉西泮/替乐胺和5 mg/kg噻嗪嗪的混合物。用0.5%托品酰胺和0.5%盐酸肾上腺素的混合物扩瞳,玻璃体腔注射EGFP表达AAV载体。
 
激光诱导脉络膜新生血管形成的研究:麻醉和瞳孔扩张后,用PASCAL二极管眼科激光系统对小鼠进行激光光凝。参数为:200μm光斑尺寸,0.02 s持续时间,100毫瓦功率。在每个动物的右眼视神经头周围制作四至五个激光点,以诱导CNV。通过观察每个激光光斑上的气泡,证实了bruch膜的破裂。玻璃体腔注射激光光凝后5天,用扫描激光检眼镜检查FFA。动物麻醉,瞳孔扩张观察视网膜。. 用0.1毫升2%荧光素钠腹腔注射后3~5分钟采集FFA图像。从图像中观察到CNV的形成是通过观察激光光凝损伤周围的染料渗漏来证实的。
 
玻璃体内注射AAV:激光光凝后五天,在瞳孔扩张麻醉下右眼注射AAV,使用30G锐针和35G钝针配合NanoFil注射器。给药之前,使用尖锐的30g针尖,在角膜缘后约0.5毫米产生巩膜切开术。注射用的AAV2-EGFP、AAV5-EGFP和AAV-EGFP一微升用于注射。玻璃注射器是用注射器安装35G钝针,同时用手术显微镜直观地显示眼底。十和五只小鼠,分别用CNV和无CNV注射AAV血清型;因此,总共有45只小鼠接受玻璃体内载体给药。
 
结果:增强视网膜脉络膜新生血管AAV转导效率的实验研究:为了观察CNV诱导的小鼠视网膜AAV转导效率,激光光凝同心地在视神经头周围进行。在激光光凝5天后,通过对眼底荧光血管造影(FFA)中激光损伤的识别来证实CNV的形成。通过评价EGFP在后眼部图像中的表达,测定了三例AAVV血清型的转染效率。在不接受AAV注射的眼睛中,有或没有CNV视神经末梢周围可见微弱的自体荧光。在无CNV的眼睛中,AAV2给药的眼睛在整个眼底表现出弥漫的、分散的EGFP表达,而AAV5和AAV8注射的眼睛在视神经头和主要血管周围表现出少量的EGFP表达。在CNV眼中,所有AAV血清型的转导效率在CNV病灶周围增加。AAV2显示了最高的转导效率,如在整个眼底可见强健的EGFP表达。与无CNV的眼相比,AAV5和AAV8转导增强,并且集中在CNV病灶周围。与对照眼相比,AAV注射眼的荧光强度显著升高,不论何种AAV血清型。与无CNV相比,CNV眼的荧光强度显著增加,与AAV血清型无关。
 
CNV存在下AAV向视网膜细胞的转导:横截面允许通过不同的载体识别不同细胞类型的转导模式。在AAV2/CNV眼中,视网膜神经纤维层和视网膜神经节细胞中的载体转导明显,并在内核层(INL)中散发性转导。在AAV5/CNV和AAV8/CNV眼中,EGFP在视网膜神经节细胞层和内丛状层中的表达可忽略不计。在CNV眼中,AAV血清型之间的转导模式不同。在AAV2/CNV+眼中,CNV形成导致视网膜神经节细胞层(GCL)、INL细胞、外核层(ONL)细胞视网膜色素上皮(RPE)细胞和CNV病变细胞向细胞扩散传导;EGFP的表达在RPE层中显著增加,甚至在CNV病变之外。 相反,在AAV5/CNV+和AAV8/CNV+眼睛中,AV转导在GCL细胞、INL细胞、ONL细胞、RPE细胞和CNV病灶中的细胞中增强,更多局限于病变区域。注射AAV8的眼睛与注射AAV5的相比,表现出更为弥漫的转导模式。
 
CNV存在下AAV向Müller细胞的转导:用抗EGFP和抗GFAP抗体双重免疫法评估AAV转导Müller细胞。CNV的诱导导致靠近CNV病灶的Müller细胞广泛的胶质细胞增生和GFAP表达上调。GFAP + Müller细胞可被所有AAV血清型转导。与无CNV的眼相比,在CNV的存在下,AAV2在Müller细胞中的转导增强,AAV5和AAV8的嗜性改变。. AAV5和AAV8在正常视网膜中不转导Müller细胞,但在CNV存在下转导这些细胞。在三种血清型中,AAV2的转导效率在CNV的存在下表现出与缺失相比最大的增加。
 
AAV转导的细胞类型鉴定: 为了鉴定AAV转导的细胞类型,我们进行了进一步的免疫组织化学分析。CNV病变包括炎症细胞和脉络膜下方产生的血管组织。使用抗CD11b、F4/ 80和CD31的抗体分别检测EGFP+细胞,它们是单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞的标记物。在注射AAV2的眼中,CNV病变中检测到CD11b表达,ONL和INL也检测到CD11b表达。CNV病变中的几种EGFP+细胞也为CD11b阳性。病灶附近也有阳性。F4/80免疫染色显示与CD11b相似的模式。F4/80的表达主要见于GCL、ONL、视网膜下间隙和CNV病灶。在视网膜下间隙和CNV病变中检测到F4/80 +细胞,在后者中,一些F4/ 80 +细胞也是EGFP+,表明AAV2的有效转导。CD31染色定位于神经视网膜和脉络膜的血管组织,以及CNV病变。EGFP和CD31染色共定位显示CNV病变血管内皮细胞AAV转导的适度水平. 在注射AAV5或AAV8的眼睛中,载体转导的CD11b和F4/80 +细胞被局限于视网膜下间隙和INL。EGFP和CD31表达共定位显示CNV病变浅层血管组织中AAV5和AAV8的转导.
 
讨论:我们的研究小组用AAV mTOR shRNA证明了NAMD基因治疗的可行性。玻璃体内给药AAV2有助于靶向CNV病变,但我们没有证明特定视网膜细胞类型的载体转导。由于视网膜的病理条件可能改变视网膜细胞的载体转导,因此有必要评估病毒载体在视网膜病变中的转导效率。注射AAV2的眼睛表现出弥漫的、健壮的EGFP表达,而注射AAV5和AAV8的眼睛更为温和。CNV后观察到明显的胶质增生和Müller细胞活化,三种血清型AAV转导的活化Müller细胞。CNV病变的炎性和内皮细胞被AAV2有效转导,AAV5和AAV8在CNV病变的浅层中转导了周围炎性细胞和血管组织。AAV载体通常是视网膜下或玻璃体内给药。视网膜下注射需要侵入性手术,其中局部视网膜脱离是不可避免的。玻璃体内注射是一种安全和简单的程序,但导致有限的载体转导到视网膜细胞。为了开发更安全和更有效的给药方法,一些研究试图克服玻璃体内AAV给药的缺点。病毒衣壳的修饰增强了病毒载体在视网膜中的各种细胞类型的转导。以前报道了激光凝固术后玻璃体腔注射AAV显著增强视网膜神经节细胞、Müller细胞、感光细胞和视网膜色素上皮细胞的转导. 激光光凝诱导CNV损伤布Bruch膜,随后出现异常新生血管和广泛炎症。病变视网膜中AAV载体转导增强的概念,暗示了视网膜疾病基因治疗的潜力。目前,抗血管内皮生长因子治疗是AMD治疗的主要策略,有充分证据表明NAMD对减少渗出和视网膜厚度和改善视力具有重要作用。抗VEGF治疗对消除异常血管的作用有限,特别是当血管组织处于成熟状态时。在这项研究中,AAVs根据不同的血清型转导CNV病灶周围和周围的炎性细胞和内皮细胞,并且我们的组最近证实AAV-mTOR shRNA在CNVs转导内皮细胞并显示直接抑制。mTOR的离子有效地减少了CNV的大小,推测是由于自噬增加。考虑到炎性和内皮细胞是CNV直接转导这些细胞的主要成分之一,治疗基因可以解决目前抗VEGF治疗的局限性,并且可以获得增强的消除CNV的治疗效果。
 
结论:我们用CNV评估了AAV2、5、和8在小鼠视网膜中的转导模式。所有三种血清型表现出增强的转导和周围CNV病变。AAV2在CNV病变中被有效地转导到炎性和内皮细胞中,而AAV5和AAV8仅在浅层CNV病变中转导内皮细胞。我们的研究结果将有助于眼科基因治疗,特别是NAMD的研究,旨在确定最佳的AAV血清型作为用于视网膜疾病基因治疗的递送载体。
 
相关文章
  • 没有相关内容!
点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息