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糖苷酶改善小鼠玻璃体内注射基因递送的有效性和安全性

2018年07月04日 浏览量: 评论(0) 来源:Molecular Therapy - Methods & Clinical Development Volume 9, 15 June 2018, Pages 192-202 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:虽然视网膜下矢状递送主要使用至今,玻璃体内递送具有潜在的优势,如果可以克服低视网膜转导效率。病毒基因递送对于治疗视网膜疾病具有很大的希望。为此,我们研究了联合注射糖胺聚糖降解酶单独或联合使用AAV2作为增加视网膜转导的方法的效果。
背景:虽然视网膜下矢状递送主要使用至今,玻璃体内递送具有潜在的优势,如果可以克服低视网膜转导效率。病毒基因递送对于治疗视网膜疾病具有很大的希望。为此,我们研究了联合注射糖胺聚糖降解酶单独或联合使用AAV2作为增加视网膜转导的方法的效果。使用健康小鼠的实验表明,这些酶增强视网膜转导。我们发现肝素酶III产生了最大的个体效应,与透明质酸裂解酶结合得到了进一步的增强。单独与AAV2比较,这种优化的AAV2酶组合导致视网膜晚期视网膜变性的转导明显改善。通过闪光视网膜电图测量视网膜功能的安全性研究表明,在急性期和酶治疗后至少12个月,视网膜功能不受影响,而瞳孔测量证实视网膜神经节细胞活性不受影响。酶注射不改变视网膜形态。这些数据共同证实了这种玻璃体内方法在提高啮齿类动物AAV视网膜转导效率方面的有效性和安全性。将这种方法转化为其他物种,如非人类灵长类动物,或临床应用将面临挑战,并需要进一步研究。
 
关键词:视网膜  AAV基因治疗  黏多糖  糖苷酶
 
简介:遗传性视网膜退化是失明的主要原因。在大多数形式中,基因突变影响外视网膜中的细胞,即光感受器和视网膜色素上皮(RPE)-使这些细胞成为新兴基因疗法的首要目标。证明通过腺相关病毒(AAV)载体通过视网膜下注射向RPE传递治疗转基因的安全性和有效性。在晚期视网膜变性中,视网膜会变得薄而脆弱,制作AAV载体视网膜下递送具有挑战性且易发生并发症。另一种方法是玻璃体内注射,技术不复杂,并发症风险较低。从玻璃体达到视网膜的转导水平的治疗提出了挑战,并已成为一些最新的临床前基因治疗研究的焦点。目前正在开发基于AAV的载体,其能够通过合理的诱变或体内定向进化,在玻璃体内注射后转导动物模型中的外视网膜。合理的诱变处理病毒衣壳(表面暴露的酪氨酸、苏氨酸和赖氨酸残基)以减少载体的细胞内泛素化和蛋白体降解,从而导致视网膜转导增加。定向进化从组合库中选择AAV变体,体内具有理想的细胞嗜性。因此,通过多个进化周期,它丰富了具有特定细胞取向的AAV变异体或能够通过改变的受体结合性质从玻璃体到达外视网膜。这些新的AAV变体已被证明能在视网膜变性动物模型中产生更有效的疾病表型的功能拯救。
 
玻璃体内递送后增加视网膜转导的另一种策略是解决视网膜屏障穿透的物理障碍。自然产生的AAV血清型产生有限的视网膜内转导,并且通过玻璃体内传递不有效地转导外视网膜,因为玻璃体、内界膜(ILM)、视网膜细胞外基质(ECM)和细胞表面蛋白聚糖形成实质性屏障,固定AAV颗粒的结合位点。使用糖苷酶,这些屏障的酶裂解提高了载体穿透的深度和效率,从而导致更有效的视网膜转导。用非特异性蛋白酶链霉蛋白酶E消化ILM也增强了视网膜转导,提示ILM形成了载体穿透的重要障碍。我们描述了一个优化的方法,小鼠通过共同注射糖苷酶实现玻璃体内传递无变化的AAV2以增加视网膜转导。我们对AAV2与多种糖苷酶(包括软骨素ABC裂解酶、透明质酸裂解酶、肝素酶III及其组合)的转导效率进行了定量和定性分析,发现肝素酶III和透明质酸裂解酶的组合在AAV2载体上产生了视网膜穿透的最大改善,并且在完整的野生型视网膜中总的转导水平最高。
 
方法:本研究采用成年C57BL/6J(野生型)和C3H/HEJ(RD1)小鼠。
 
通过AAV基因传递:本研究所用的AAV2载体是从载体实验室获得的。在双极细胞启动子(GRM627)上特异性的细胞,融合了200个bp的GRM6基因增强序列,该基因编码的是双极细胞特异性代谢型谷氨酸受体、MGLUR6和SV40真核启动子,称为AAV2-GRM6GFP,由反向末端重复序列(ITR)DOMAI围绕。在8周龄的异氟烷麻醉小鼠体内注射病毒载体。在注射前,用托吡卡胺和去氧肾上腺素扩张瞳孔。在5μL的玻璃注射器上安装了一个定制的超细针头,并45°穿过扁平部进入玻璃体腔,无视网膜穿孔。在手术显微镜下,直接注视针尖进行注射,小心避免晶状体接触和血管。AAV2-CAG-GFP在低剂量或高剂量下注射。AAV2-GRM6-GFP仅高剂量下注射。低剂量载体注射1μl,2×1011 GC/ml,高剂量载体注射3μL, 1×1013 GC/ml。注入酶的每只眼睛接受0.5μl的PBS。从嗜酸变形杆菌中分离出0.125个单位的软骨素ABC裂解酶,由肝素黄杆菌或单独或不同组合的透明链霉菌透明质酸裂解酶组成的肝素酶Ⅲ。通过在无菌PBS中溶解酶,在注射当天新鲜地制备酶溶液。在注射前立即将载体和酶混合在注射器中,并在单一组合注射中给予。
 
组织学:在光镜下取角膜和晶状体后,在PBS中用4%多聚甲醛(PFA)固定眼睛。然后将组织在PBS中洗涤,然后在4℃下在含有30%蔗糖的PBS中孵育。固定的眼睛在PBS中冲洗,并在光学显微镜下仔细地解剖整个视网膜。然后用装有DAPI的荧光安装介质平贴视网膜以染色细胞核。,固定眼睛在最佳切削温度培养基中冷冻保存,在-80℃冷冻,直到进一步处理。使得每个部分包含视网膜的完整的鼻颞横截面。在分析之前,将切块从冷冻室中取出,允许在室温下空气干燥1小时,安装有DAPI的荧光安装介质染色细胞核。
 
生物成像:使用多个目标在直立荧光显微镜下进行成像,并使用CaleSnAPES ES相机拍摄图像并通过Meta VAVE软件进行处理。然后使用Image J软件分析图像。
 
载体转导的定量分析:对于视网膜切片中GFP+细胞的定量,每个治疗组(n=4)每眼一个切片(6~8个节段)用于分析,将所有切片在10×再拍摄,计数GFP+细胞。根据GFP +细胞的层流位置和形态鉴定了转导的GFP+细胞。根据视网膜层进行GFP +细胞计数和记录,包括GCL,INL和ONL。
 
ERG: 玻璃体内注射后1周、6周和12个月对野生型小鼠进行视网膜功能评价。小鼠暗适应过夜(>12小时),并在暗红光下制备ERG记录。腹腔注射氯胺酮(75 mg/ml,10%)和甲苯噻嗪(13.6 mg/ml,20%)的混合物诱导麻醉。瞳孔用局部散瞳扩张,然后放置羟基丙基甲基纤维素溶液滴在角膜接触镜型电极上。电极通过信号调节器连接到个人计算机,信号调节器差分放大(×3000)和滤波信号,以及数字转换器。
 
结果:糖苷酶增加玻璃体中AAV2的体内转导效率:为了描述通过低剂量AAV2载体介导的报告基因(GFP)的表达,我们单独或联合糖苷酶,将2×108基因组计数(GC)/眼AAV2-CGA-GFP载体注入成年野生型小鼠的玻璃体中。正如预期的那样,单独使用AAV2-CGA-GFP,存在弱的基因表达,并且这局限于内视网膜。相反,当AAV2-CGA-GFP与糖苷酶软骨素ABC裂解酶、透明质酸裂解酶或肝素酶III一起注射时,GFP在视网膜神经节细胞层(GCL)和内核层(INL)中的表达显著增加,证实了我们以前的发现。我们测试了各种酶的组合,包括软骨素ABC裂解酶+肝素酶III,软骨素ABC裂解酶+透明质酸裂解酶,和肝素酶Ⅲ+透明质酸裂解酶,并发现它们进一步增强GFP表达。最强的转导实现了肝素酶III和透明质酸裂解酶的组合,它在整个GCL和INL中产生健壮的GFP表达,一些区域也具有适度的视网膜外转导。AAV2-CGA-GFP的转导效率的定量评估显示,在每毫米的视网膜切片中添加糖苷酶透明质酸裂解酶或肝素酶III,GFP +细胞体的数目显著增加。其中,肝素酶III比单独软骨素ABC裂解酶产生更多的视网膜转导。当使用糖苷酶的组合时,它们也显示了与未用酶处理的眼睛相比,转导效率的显著改善。特别是,肝素酶III和透明质酸裂解酶导致GFP +细胞的最高计数。与未增强的AAV2-CaGGFP介导的转导相比增加了17倍。在GCL和INL细胞中,这种增加是显著的,而不是在外核层(ONL)细胞体中。
 
大剂量AAV2载体联合肝素酶Ⅲ和透明质酸裂解酶在野生型小鼠中的应用:为了确定用这种技术可实现的转导程度,我们将最有效的组合(肝素酶Ⅲ+透明质酸裂解酶)与较高剂量的载体应用。野生型小鼠注射了肝素酶III和透明质酸裂解酶,同时加入高剂量的AAV2-CGA-GFP(3×1010 GC/眼)。单独注射PBS的视网膜中未观察到绿色荧光信号。与单独注射高剂量载体相比,在糖苷酶存在下增加载体剂量导致GCL和INL中细胞的广泛视网膜转导。观察到视网膜外传导(ONL),处于较低水平。这种片状表达可能是由于酶和载体通过玻璃体的非均匀扩散,导致注射部位附近更有效的视网膜转导。
 
AAV2载体结合糖苷酶导致RD1视网膜中报告基因的强健表达:我们研究了Adv2在RD1视网膜中的转导--一种晚期视网膜变性模型。我们用肝素酶Ⅲ和透明质酸裂解酶将AAV2-CGA-GFP载体(3×1010 GC/EVE)注入成年RD1小鼠的玻璃体中。注射6周后获取视网膜,在GCL和视神经细胞和INL细胞中观察到与单独AAV2-CGA-GFP相比的强报告基因表达。GCL中的表达是一致的,而INL转基因表达,虽然泛视网膜,显示更多不同的密度和深度。我们注射AAV2与一个双极特异性启动子结合糖苷酶驱动GFP表达,并发现,正如预期的那样,限制在INL中的细胞的表达。GRM6/SV40增强子启动子序列已在多个研究中显示,仅在双极细胞中表达。
 
结论:我们已经开发了一种AAV介导的治疗,通过玻璃体内注射改善视网膜转导,在啮齿类动物中具有优良的长期安全性。用这种方法将杆状视素递送到RGC和双极细胞上,成功地挽救了视网膜变性的晚期模型。玻璃体内注射后,它有可能有效地将AAVs送到视网膜外,并且可以通过将工程载体与这些糖苷酶结合来进一步改善。
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