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模型制备

A(H1N1)流感病毒感染雪貂模型的制备

2020年07月02日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见和新发传染病动物模型》 作者:张连峰 秦川 主编 责任编辑:yjcadmin

1.雪貂血清学筛选  雪貂在感染前进行流感的血清学筛选,至少目的流感病毒血清学检测结果为阴性的动物方可入组。

2.材料和方法

(1)实验用病毒:为SPF鸡胚传代所收获的尿囊液。测定病毒液TCID50为10的7次方/ml。

(2)动物及感染方法:4~10月龄雪貂,体重500~1000g,感染前进行血清抗体检测,检查A(H1N1)病毒抗体及当即流行的流感的抗体为阴性的雪貂为合格,可入选实验。雪貂经鼻腔接种10的6次方TCID50(500μl体积)。所有动物实验均在ABSL-3实验室中进行。感染的第5天安乐处死雪貂取材。

(3)临床观察:雪貂实验前皮下植入芯片,每天通过芯片读取体温一次,每天称量体重一次,观察有无咳嗽、流涕、呕吐、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲缺乏等临床表现,详细记录备案。

(4)病毒分离:在病毒接种1d后,每天收鼻甲骨活检物,放入1ml DMEM培养液中备用。标本接种MDCK细胞,吸附1h,进行病毒分离。感染后第5天感染雪貂安乐处死,尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织,研磨处理后接种MDCK细胞。每天观察细胞病变,持续观察3天,用火鸡血细胞测定HA确认。HA方法具体为:将接种标本的 MDCK细胞上清液取出50μl,加入等体积火鸡血细胞,室温反应30min,出现凝集反应,结果为阳性。

(5)H1N1病毒RNA的检测:在H1N1病毒接种动物1d后,每天收集鼻甲骨活检物,在ABSL-3实验室内提取病毒RNA,操作步骤:将100μl鼻甲骨活标本移入裂解液(Qia- gen)中,放入buffer RLT(已加入1%巯基乙醇)350μl,4℃13000次/分离心3min,将上清转移至新1.5ml微量离心管中,提取鼻甲骨活检物样品病毒核酸。将RNA逆转成cDNA,通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。

(6)H1N1病毒抗体检测:动物在处死后采血分离血清,-80℃下保存备用。血清 H5N1病毒性抗体检测(H1方法)具体操作步骤为:每孔加入1:10~1:1280稀释的待检血清,加入8HA的病毒,室温孵育30min。此后检测凝集结果,血清凝集的效价为该血清可中和的抗体的效价。

(7)病理学研究:大体观察,处死动物后,详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠以及淋巴结等组织的形态变化;病理切片制备,取处死动物的肺等组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规病理组织切片处理后,HE或免疫组织化学染色后,镜检观察。

3.雪貂感染A(H1N1)模型指标和结果  雪貂在实验前1周测正常体温和体重,确定正常值,雪貂在H1N1病毒接种的第2天时体温升高,体温升高0.5~1℃,体温升高持续1~2d左右,临床没有死亡现象。雪貂感染后出现流涕,打喷嚏,有呼吸困难,摄食减少,精神萎靡,活动度下降等临床表现。病毒感染雪貂后第1~5天,用RT-PCR方法可从鼻甲骨活检物中检测到病毒载量,病毒载量呈现下降趋势。雪貂的鼻甲骨标本经MDCK细胞培养,结果显示感染后第1~2天的鼻甲骨标本可分离出病毒,此后结果为阴性。

肺组织和肠组织可分离到活病毒,未在其他组织分离到病毒。大体观察可见肺组织局灶性充血改变,呈暗红色。镜检可见肺组织呈局灶性中-重度肺炎改变,部分肺组织病变较轻,呈局灶性间质性肺炎改变,表现为肺泡间隔增宽,肺泡壁毛细血管充血、炎细胞浸润。部分肺组织病变较重,表现为肺静脉及肺泡壁毛细血管明显扩张充血,部分肺静脉壁及周围组织明显水肿,局部支气管及肺泡上皮细胞坏死、脱落,肺泡腔内可见大量渗出和漏出的红细胞、水肿液、炎细胞及坏死脱落的上皮细胞碎屑,有时可见病灶广泛融合,累及大部分甚至整个肺叶,见图8-5。


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