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转基因大鼠—突破技术限制,发挥在特定领域的研究优势

乘风破浪的大鼠——如何突破技术限制再次发挥在特定领域的研究优势

2020年08月13日 浏览量: 评论(0) 来源:赛业生物 作者:小赛 责任编辑:admin
摘要:与小鼠相比,大鼠在生理特征、形态和基因上更加接近人类,同时大鼠较大的身体和器官尺寸便于多次采样,以及进行体内电生理学、神经外科和神经影像学程序操作,因此,相对小鼠来说,大鼠更合适用于毒理学、畸形学、内分泌学、肿瘤学、神经病学、实验老年学、心血管、牙科和实验寄生虫学等领域的研究。

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建立合适的疾病动物模型是基础医学科研中非常重要的研究方法,大鼠和小鼠是疾病研究中的主力军。由于体积小、成本低,特别是胚胎细胞相对稳定,方便进行各种遗传操作,进行基因编辑这个优点,使得小鼠成为解析人类基因功能最重要的模式生物。但是,与小鼠相比,大鼠在生理特征、形态和基因上更加接近人类,同时大鼠较大的身体和器官尺寸便于多次采样,以及进行体内电生理学、神经外科和神经影像学程序操作,因此,相对小鼠来说,大鼠更合适用于毒理学、畸形学、内分泌学、肿瘤学、神经病学、实验老年学、心血管、牙科和实验寄生虫学等领域的研究。接下来我们将重点探讨大鼠与小鼠有哪些差异?这些差异使得在哪些研究领域更适合选择大鼠?如何最大化地发挥大鼠的优势进行研究? 

大鼠与小鼠主要有哪些差异?

首先是在与人类的相似性方面,虽然大鼠小鼠和人类进化的差异区别很小。但大鼠某些方面与人类更为接近,比如小鼠的心率可以达到600 bpm,而大鼠则降低到了300 bpm左右,与人类的70 bpm更为接近。基因组上看,小鼠为26亿对,大鼠27.5亿对,与人类的29亿对更为接近。染色体方面,小鼠20对,大鼠和人类分别是21和23对。 

SD大鼠和C57小鼠是生物医学研究中(尤其是神经生物学研究)中最常用的大鼠和小鼠代表,最近的研究通过基于基因芯片分析发现在检测到的10,833个基因中,有4713个基因在大鼠和小鼠的海马神经元树突中存在表达差异。而同样也是采用基因芯片技术研究海马神经元,只有54个基因在C57BL/6和BALB/c两个最常用的小鼠品系之间有差异表达。考虑到海马体在行为(尤其是学习记忆)中的重要性,这一发现很好地解释了大小鼠行为方面的不同。同样地,研究人员还比较了大鼠和小鼠的其他组织(包括心脏、骨骼肌、肠子等),尽管这些组织的差异也很大,但它们远没有海马体中的差异那么明显。不过这也足够提醒我们要注意大小鼠之间实验结果的差异。大鼠和小鼠之间最明显的区别之一是在大小和体重上,成年大鼠的体重大约是成年小鼠的8到10倍,体型方面对科研造成的影响则是有利有弊。 

哪些研究领域更适合选择大鼠?

1)大鼠是研究心血管疾病极好的模型,尤其是中风和高血压,而且有多种品系的大鼠模型已经成为这些研究的理想对象。

2)大鼠乳腺癌模型优于小鼠模型,因为它们对组织病理学有激素反应,并且具有更接近人类疾病的癌前阶段。

3)大鼠是人类生殖力学研究的主要模型。

4)在糖尿病模型中,大鼠模型在一些重要的方面与人类更为接近,包括环境因素(如毒素、压力、饮食和疫苗接种)改变疾病的能力。

5)经退行性疾病方面,Pink1和DJ-1敲除的大鼠在8月龄时表现出中脑黑质多巴胺神经元50%以上的丢失,相比于小鼠表型的不明显,大鼠基因编辑模型给了我们更多治疗帕金森病的希望。这也是第一次在基因编辑动物模型中发现多巴胺神经元的丢失。同时这些大鼠也在检测运动神经元功能的行为学实验中出现了症状。

6)小鼠在行为学上的一致性比较差,通常需要每组数量在大鼠的1.5倍时统计所得的结果才相对可靠。大鼠比小鼠更聪明,在学习记忆实验中具有更好的表现,因此药物对它们的影响也更为明显。在疼痛研究方面,大鼠不容易出现小鼠中常见的焦虑引起的痛觉麻木,事实上,痛觉相关的文献数量上大鼠从来没有被小鼠打败过。

7)过去的临床前研究在小鼠实验中验证了药物的有效性之后,还需要在大鼠身上对安全性进行验证,才能进行临床的人体安全性试验,这是因为大鼠的安全性数据在历史上积累丰富,参考性很强。在大鼠基因编辑成熟之后,人们便可以在大鼠身上直接和同时进行有效性和安全性的检测,节省了时间。

8)大鼠的大体型提供了许多实际的优势,特别是在外科手术和脊髓损伤的研究中,大鼠模型在这方面具有很大的转化价值。同时在器官组织成像研究中也比小鼠更有优势。 

近年来在医疗科研领域,从临床前向临床转化的过程中,大量基于小鼠的研究以失败而告终,这让人们不得不静下心来思考是否我们还是需要与这些人类疾病更相关的动物模型,在这个背景之下,科学家们又将目光重新投向了大鼠,因为比起开发新的模式动物所需投入的巨大时间和资金投入,大鼠算是人们的了“老朋友”了,而且大鼠在基因编辑时代的潜力还远未得到充分开发。 

如何最大化地发挥大鼠的优势进行研究?

随着人们对大鼠胚胎控制能力的增强以及CRISPR/Cas9技术的到来,拓展了大鼠做为实验模式动物在基础研究及药物筛选、临床前药物评价的应用范围。但是,作为最重要的基因条件性表达方案,Cre-LoxP系统中大鼠品种相对小鼠种类上要少了很多,这一点严重阻碍了我们对大鼠的应用。Cre-LoxP系统在小鼠中的应用已经相当广泛了,很多基因都有对应的LoxP小鼠存在,同时特异性启动子的Cre小鼠资源也相当丰富。但是在大鼠中,由于基因编辑技术发展的落后,目前无论是LoxP大鼠还是连接了组织特异性启动子的Cre大鼠,它们的种类都要远低于小鼠。赛业生物针对超排大鼠胚胎受精比例低而畸形胚胎比例高,卵细胞品系和个体间差异大,核膜和质膜更厚更有弹性导致更难注射等多项难点,不断优化生产过程各个环节,攻克多项技术难关,可实现更复杂的条件性基因敲除大鼠模型创建。赛业生物可为您提供基因敲除、点突变、基因敲入等多种基因编辑大鼠服务,还可为您提供SD、Wistar、Long Evans、F344、Brown Norway大鼠等多种品系选择,致力于为您构建更好的大鼠模型。赛业生物正在着手建立一个Cre模型库,其中包含各种大小鼠品系,以供全球研究人员使用。

现有Cre大鼠品系如下:

alb(Cre Ert2)alb(Cre)
myh6(Cre Ert2)myh6(Cre)
slc6a3(Cre Ert2)slc6a3(Cre)
camk2a(Cre Ert2)camk2a(Cre)
gfap(Cre Ert2)gfap(Cre)
nes(Cre Ert2)nes(Cre)
nphs2(Cre Ert2)nphs2(Cre)

备注:除以上列出的Cre大鼠模型外,如您需要其他品系的大鼠模型,可拨打400-680-8038联系我们,以获取专属的定制服务报价。 

考虑到Cre大鼠需要与LoxP大鼠杂交一至两代才能得到条件性基因编辑动物,同时Cre酶也存在效率和一定概率的泄露问题,可能会对科研进度产生影响,病毒诱导的大鼠基因过表达/敲除/敲入/点突变便应运而生。 

目前主要使用的病毒表达系统有三种,即腺病毒(Adeno)、慢病毒和腺相关病毒表达系统,这些病毒系统各有优缺点:

1)腺病毒的优点是表达效率高,表达起始时间早,可包装DNA片段相对最大,但有很强的免疫原性和毒性,一般适用于离体细胞转染,用在活体上的话动物死亡率高,实验窗口期短。 

2)慢病毒则可以逆转录成DNA,并永久整合到宿主基因中,因此目的基因可以长期稳定表达,慢病毒是最常用的基因传递病毒系统,并且具有比腺病毒小得多的免疫原性。虽然也可以用作活体转染,但是在滴度,效率和免疫原性都更好的腺相关病毒面有些“相形见绌”。 

3)腺相关病毒的最大优势在于极低的免疫原性可以在最大可能地保证自己能与宿主长期共存。生物安全性也很高,可以在生物安全等级较低的实验室中进行实验,种类繁多的血清型使得其对不同组织的亲和度有区别,使得即便在全身注射的情况下仍然具有很强的组织特异性,辅以定位注射的话,可以大大提高实验的组织细胞精度,是最适合活体实验的工具病毒,但也存在克隆容量不足的问题。 

图1webp3.jpg

图1. 三种常见病毒载体比较 

综合三种工具病毒的优缺点来看,在与Cre或者LoxP动物联用方面,AAV介导的组织特异性表达具有相对于另外两种病毒系统更好的效果。 

图21.png

图2.不同AAV的组织特异性 

正因为AAV的这些优点,得以使其在与Cre或者LoxP大鼠鼠的配合中大放异彩。这是因为虽然人们正在开发更多的LoxP和Cre大鼠,但这个过程并非一蹴而就。考虑到大鼠中Cre酶的效率和有可能存在的泄露问题,可能导致开发时间会变得更长。因此,目前最佳策略是在开发Cre和LoxP大鼠的同时,利用AAV病毒先行对已有大鼠进行组织特异性操作。病毒载体的构建总是要比动物繁殖到可用于实验的数量所需时间要少得多。因此可以通过这种方法尽快对动物的表型进行研究和验证,尽早决定下一步的研究策略和方向,节省科研人员宝贵的时间。 

需要注意的是,AAV注射所产生的特异性表达并非仅仅只是节省时间的“权宜之计”。由于生命科学研究中体内实验的不确定性,以及目前开发出来的越来越丰富的研究手段,要想研究结果得到认同,多种方法交叉验证也能为自己的论文质量增加砝码。 

此外,Cre-LoxP动物虽然在对基因的空间特异性研究方面已经很成熟了,也存在转入的启动子在多个组织中同时表达的情况,而如果这时我们的焦点仅仅是一种组织,那么其他组织中Cre的表达仍然会对我们的研究精度产生干扰。AAV的定点注射恰好可以完美地解决这个问题,因为我们只需要在自己想要研究的组织中注射病毒就好,区域特异性很强。 

为了进一步利用好手头的基因编辑鼠,AAV注射的方案也可以分为两种,一种是如果手头有LoxP的大鼠,可以注射AAV包装组织特异性的Cre;反过来,如果手头有Cre大鼠,则可以反过来注射包装了连端有LoxP位点的目的基因或者其他元件的病毒。不过一般而言,对组织特异性Cre进行AAV包装更为常见。 

图3. AAV病毒包装DNA与大鼠联用进行条件性表达 

虽然AAV介导的条件性基因编辑有着上面所提到的诸多优点,但凡是有利就必有其弊。AAV注射的弊端首先就在于其包装片段长度短,这就注定一些大片段的基因无法采用这种方法,使其适用范围受到局限,经常需要在报告基因等附件基因元件上做出取舍,Cre基因之前启动子的选择也比较受限制;另外一点就是有一定的学习成本,这个成本包括时间和资金花费,尤其是脑部注射,由于要精确到不同的脑区,而老鼠的脑子本来就不大,而且由于年龄,性别,品系,生长史等原因,每只动物都并不会完全长成图谱中的样子,所以要精确掌握给药位置是需要狠下一番功夫的;病毒由于是外源物,并非细胞本身产生,因此会出现注射部位的浓度分布不均,从而对实验结果造成影响,这很好理解,注射的中心部位的病毒含量肯定是要高于周边的。最后就是成本问题,虽然大多数情况下采用AAV进行条件性表达的成本是要低于Cre-LoxP小鼠的,但也有两种情况例外,首先就是如果我们采用的是全身性注射,病毒的消耗量也是很大的,而且随着注射病毒动物数量的增加,病毒的花费可以说是线性增长的;而采用杂交小鼠的方案则不同,虽然前期投入以及动物的饲养都是大量经费的燃烧,但是一旦品系构建成功,不出意外的话可以持续使用,后期的费用就是饲养普通动物的费用水平了,呈边际递减状态。 

总而言之,只有充分考虑两种方法的利弊之后再进行决策才能将其运用自如,在条件允许的情况下,AAV辅助条件性敲除动物和传统的Cre-LoxP动物即有互补性,又能相互验证,在加上大鼠本身的优点,在代谢,心血管和神经等方面将具有无穷的潜力,为这些疾病提供更完善的模型,成为生物医药研究中不可或缺的助力。

 _工具病毒模式动物
周期
空间选择
时间选择性
片段长短短(4k以下)
操作难度
制作难度
稳定性
成本

图4. 工具病毒与模式动物比较

参考文献:

1.  Dietrich, M.R., R.A. Ankeny, and P.M. Chen, Publication trends in model organism research. Genetics, 2014. 198(3): p. 787-94.

2.  Haery, L., et al., Adeno-Associated Virus Technologies and Methods for Targeted Neuronal Manipulation. Front Neuroanat, 2019. 13: p. 93.

3. Tsien, J.Z., Cre-Lox Neurogenetics: 20 Years of Versatile Applications in Brain Research and Counting. Front Genet, 2016. 7: p. 19.

4. Meek, S., T. Mashimo, and T. Burdon, From engineering to editing the rat genome. Mamm Genome, 2017. 28(7-8): p. 302-314.

5. Balakrishnan, B. and G.R. Jayandharan, Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy. Curr Gene Ther, 2014. 14(2): p. 86-100.

6. Kim, H., et al., Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 34(4): p. 147-159.

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