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模型制备

去窦弓神经鼠类动物的血压模型

2020年10月23日 浏览量: 评论(0) 来源:《心血管病实验动物学》 作者:霍勇 陈明 主编 责任编辑:yjcadmin

一、概述

动脉压力感受性反射(arterial baroreflex, ABR)是调节心血管活动的重要机制之一,广泛参与各种心血管疾病,其重要性越来越受到重视,它的整个调节过程大致如下:颈动脉窦和主动脉弓的压力感受器感受到血压等指标的变化,将信号经窦弓神经传入,汇总至舌咽神经和迷走神经上传入延髓孤束核,再经中枢整合后通过交感和迷走神经调控心血管活动,从而实现维持自身动态平衡的目的(图8-3)。因此,破坏反射弧的任一环节都会影响心血管系统的稳定。通常的办法是去窦弓神经(sinoaortic denervation, SAD)或损毁孤束核。窦弓神经是动脉压力感受性反射弧传入神经部分,孤束核属于中枢部分,两者是组成反射弧的重要环节,相对而言,SAD手术较为简单。目前,SAD动物有多种,有SAD犬、兔、猴、狒狒、人、大鼠等,因为大鼠易于繁殖,饲养简单,经济且手术较为简单,所以它在心血管研究中使用得较为普遍。

二、模型的制备

目前,大鼠SAD方法多采用Krieger法及稍作改进。

1.操作步骤  ①SD大鼠,雄性,体重在250g以下,腹腔注射5%盐酸氯胺酮和0.5%地西泮各1ml/kg麻醉(混合后一次注射),为减少手术刺激呼吸道分泌,腹腔注射0.1%硫酸阿托品0.5ml/kg:②大鼠仰卧位固定,颈部剪毛,酒精棉球消毒;③颈部正中约3cm长切口,彻底暴露胸骨乳突肌肉、二腹肌后肌腹、胸骨舌骨肌,并将胸骨乳突肌和二腹肌后肌腹推向外侧,以暴露肩胛舌骨肌外侧缘;④在右肩胛舌骨肌头端外侧内约1mm处分离肌肉,寻找横跨颈动脉的右侧喉上神经,并分离切断约2mm(鼠台转180°);⑤在左肩胛舌骨肌头端外侧内约1mm处分离肌肉,寻找横跨颈动脉的左侧喉上神经,并分离切断约2mm:⑥分离左侧颈动脉鞘,仔细分离颈动脉和迷走神经切勿刺激迷走神经!剩下的交感干、主动脉神经及动脉鞘组织切断约2mm。图8-4为左侧颈动脉窦区神经血管示意图。⑦去除左侧颈动脉分叉处内侧的颈上神经节,将颈动脉分叉处的周围组织剥离干净,分离颈内、外动脉和枕动脉,用小棉花球挡在迷走神经与动脉之间,用涂有10%苯酚乙醇的牙签从动脉分叉处穿过,反复2~3次,在将动脉分叉处周围涂抹2次,过1分钟后再将小棉花球取出缝合,后腿肌注青霉素G;⑧采用同样的方法处理右侧,即去除右侧主动脉神经、交感干、颈上神经节及窦区神经支配;⑨颈部切口缝合。假手术组动物在颈部切开后只作肌肉暴露及分离,然后缝合,肌注青霉素G 6万单位即可。在狒狒上,有人采用类似于去窦区神经支配的方法来去主动脉弓区神经支配,先开胸暴露主动脉弓区,然后剥离主动脉根部至降主动脉起始部血管的外膜,并使主动脉弓发出的3支动脉完全游离一段距离,然后用苯酚溶液涂擦这些血管四周。在犬上,为了防止窦区神经再支配,有人将颈动脉分叉破坏,具体办法为分离颈动脉分叉后将颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉在分叉处附近结扎后切断。这样的操作先在一侧进行,几周后在对侧进行,据说不会影响脑部血液供应,因为犬的脑部血液主要由椎动脉供应。

2.动物模型制备成功的判断及问题  手术上要求完全SAD是困难的。以大鼠为例,首先其主动脉神经纤细,且经常与颈交感干和(或)喉上神经伴行,手术时要求将颈交感干在交感神经节尾端离断,喉上神经在靠近迷走神经处离断,以完全切除主动脉减压神经。其次,窦神经不仅纤细,而且其末梢十分弥散,且有时窦区减压传入纤维可沿着颈动脉分叉直接加入舌咽神经(即不经过窦神经),为保证完全去除窦区神经的支配,手术时要将颈动脉分叉处血管完全游离,用苯酚溶液涂擦。

上述SAD方法实际上不仅切断了压力感受器传入纤维,还切断了化学感受器(颈动脉体)传入纤维。这样不仅减压反射受损致使心血管功能紊乱,同时化学感受性呼吸反射的受损可能会影响到呼吸功能。因此该手术对动物刺激非常大,术后存活率较低。经验上SAD术后大鼠死亡率约50%,死亡大多发生在术后1周内,且这些大鼠具有特征性行为改变,表现为活动较少、体重进行性减轻、深慢呼吸或喘气。

SAD是否完全可以进行检验,通常采用药物(如去氧肾上腺素)升压反应和(或)药物(如硝普钠)降压反应引起的心率改变来判断。目前通常以去氧肾上腺素静脉注射升压≥50mmHg时心率减慢<20次/分作为SAD完全的评定标准。

上述SAD动物模型可作为反射功能研究的动物模型。常用于动脉压力感受性反射功能的研究,也用于化学感受性呼吸反射功能的研究。SAD动物血流动力学的特殊性,即血压平均水平不高而血压波动性(blood pressure variability, BPV)显著升高,使得其成为BPV研究的良好动物模型。其次,SAD动物可作为抗高血压药物评价的动物模型。

三、临床意义

血压作为重要的生命体征之一并非固定不变,它受机体固有的生理节律和外界环境因素的影响而随时发生着适应性变化。血压波动性,又称为血压变异性(blood pressure variability, BPV),表示个体在一定时间内血压波动的程度,以24小时连续记录的血压的均数的标准差来表示,它是昼夜节律与瞬间的自发性波动在血压这个指标上的有机整合。临床研究已证实血压水平相同的高血压患者,靶器官损害的发生率及损害程度与BPV明显相关,BPV是心脑血管疾病重要的危险因素和独立预测因子。

去窦弓神经大鼠(sinoaortic denervated rat, SAD)是手术去除动脉压力感受性反射的感受器,破坏该反射功能,该动物模型血压水平正常,但血压的瞬时波动性较高,可以模拟人的血压正常水平状态时出现的异常血压波动状况。对SAD鼠的下丘脑视交叉上核(SCN)组织进行研究,可以采用半定量RT-PCR、Western Blot和免疫组化方法对中枢的下丘脑视交叉上核(SCN)组织中这些钟基因的表达水平进行定量和定位的检测分析,以判断与血压波动相关的分子变化特点。分析正常血压水平的血压波动是否影响到钟基因的表达,以及钟基因表达的变化对血压波动产生的可能影响。

从预试验中发现,正常12周龄的SD鼠行去窦弓神经术后4周,形成了SAD鼠模型,在进行了10天人工昼夜模拟后测定中枢SCN组织中per2、BMAL1基因,结果显示,与血压波动正常的SD鼠比较,SAD鼠per2、BMAL1基因昼夜表达的节律发生紊乱。这种血压的异常波动有其相应的分子基础。此外测定两组大鼠血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平后发现,SAD鼠血浆AngⅡ浓度的昼夜差异明显高于SD鼠。

为了证实在血压水平正常而血压异常波动状态下钟基因表达与中枢组织的肾素-血管紧张素系统激活状态及AT1受体表达关系,对下丘脑视交叉上核(SCN)组织中AT1受体基因的表达、及AT1受体阻滞剂(ARB)干预治疗分析血压水平正常而血压波动异常状态下中枢SCN组织中AT1受体及钟基因表达,这对评估血压波动对靶器官损害的进展具有重要的意义。

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