上海欣软信息科技有限公司
Shanghai Xinruan Informatlon Technology Co.Ltd
    您当前的位置:首页 > 公司动态页

    合欢皮对小鼠的抗焦虑作用研究-1

    • 创建时间:2015-04-02 点击数:

    内容

    合欢皮对小鼠的抗焦虑作用研究

    目 录

    摘要

    前 言

    实验一 合欢皮水提液最佳提取工艺研究

    1 仪器与试剂

    2 实验方法与结果

    实验二 合欢皮水提液对小鼠抗焦虑作用研究

    1.实验材料

    2.实验方法

    3 结果

    4 小结

    实验三 合欢皮醇提液对焦虑小鼠的行为学影响

    1 实验材料

    2 实验方法

    3 结果

    4 小结

    实验四 合欢皮抗焦虑活性部位的初步筛选研究

    1 实验材料

    2 实验方法

    3 结果

    4 小结

    实验五 合欢皮正丁醇部位木酯素含量测定

    1 仪器与试药

    2 方法与结果

    讨论

    结 论

    摘要 

    目的:观察合欢皮对小鼠焦虑行为的影响及其机制,并对合欢皮抗焦虑的有效部位进行认识。方法:通过正交实验设计研究合欢皮水提液抗焦虑最佳提取工艺。通过小鼠行为学实验,观察合欢皮水提液、醇提液对小鼠焦虑行为的影响,并通过酶联免疫吸附法测定小鼠脑内神经递质含量来探究合欢皮水提液、醇提液对小鼠抗焦虑机制行为影响;通过对合欢皮水提液及醇提液进一步的萃取分离,萃取出不同的活性部位,经行为学实验来探究合欢皮抗焦虑的活性部位;

    ①高效液相色谱法测定合欢皮中(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。

    ②通过三因素三水平正交实验设计来探究合欢皮水提液最佳工艺。

    ③合欢皮水提液抗焦虑实验:雄性小鼠,灌胃给予不同剂量的合欢皮水提液,连续灌胃 5d,然后在小鼠高架十字迷宫,明暗箱上观察合欢皮水提液对小鼠焦虑行为的影响。行为学实验结束后在冰台上取小鼠全脑用万分之一天平称重,采用酶联免疫吸附法测定小鼠脑内γ-氨基丁酸、谷氨酸和 5-羟色胺递质含量。

    ④合欢皮醇提液抗焦虑实验:雄性小鼠,灌胃给予不同剂量的合欢皮醇提液,连续灌胃 5d,然后在小鼠高架十字迷宫,明暗箱上观察合欢皮醇提液对小鼠焦虑行为的影响。

    ⑤合欢皮抗焦虑有效部位研究:取合欢皮水提液及醇提液分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取,用萃取物分别做抗焦虑行为学实验研究。行为学结束后采用酶联免疫法测定小鼠脑内γ-氨基丁酸、谷氨酸和 5-羟色胺递质含量。

    ⑥高效液相色谱法测定合欢皮正丁醇部位(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。

    结果:

    ①合欢皮抗焦虑水提液最佳工艺为 10 倍量的水,提取 2 次,每次 1.5h。

    ②合欢皮水提液各剂量组均对小鼠焦虑行为有一定的抗焦虑作用,其中合欢皮水提液中剂量组(2.5mg/kg)与焦虑模型组比较在高架十字迷宫开臂滞留时间百分比(%)(OT%),开臂进入次数百分比(%)(OE%)及穿箱次数上(TT)上均有显著性,合欢皮水提液中剂量组对焦虑小鼠的行为有一定的干预作用。与焦2虑模型组比较,地西泮阳性组与合欢皮水提液中剂量组均可提高小鼠脑内 GABA含量( P<0.05);与焦虑模型组比较,地西泮阳性组与合欢皮水提液组均可降低小鼠脑内 Glu 含量( P<0.05);与焦虑模型组比较,阳性组可显著降低小鼠脑内5-HT 含量( P<0.01),合欢皮水提液中剂量组可降低小鼠脑内 5-HT 含量。

    ③合欢皮醇提液中剂量组在开臂滞留时间百分比(%)(OT%)与焦虑模型组比较显示出显著性差异(P<0.05),其余组并未表现出显著性差异。

    ④在开臂滞留时间百分比(%)(OT%)上,与焦虑模型组比较,阳性组、合欢皮水提液组、水提乙酸乙酯组、水提正丁醇组、合欢皮醇提物组、合欢皮醇提物正丁醇萃取物组均有显著性差异(P<0.05);在开臂进入次数百分比(%)(OE%)上,与焦虑模型组比较,阳性组、合欢皮水提液组、合欢皮水提正丁醇萃取组、合欢皮醇提正丁醇萃取组均有显著性差异(P<0.05);在穿箱次数(次)(TT)上,与焦虑模型组比较,仅阳性药物组有显著性差异(P<0.05)。

    ⑤合欢皮醇提正丁醇中(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷含量高于水提正丁醇。

    结论: 

    ①合欢皮抗焦虑水提液最佳工艺为 10 倍量的水,提取 2 次,每次 1.5h。

    ②合欢皮水提液有明显的抗焦虑作用,其抗焦虑作用机制与降低小鼠脑Glu、5-HT 含量,提高脑内 GABA 含量有关。

    ③合欢皮醇提液抗焦虑作用效果不佳。

    ④合欢皮正丁醇部位有明显的抗焦虑作用,其抗焦虑作用机制与降低小鼠脑 Glu、5-HT 含量,提高脑内 GABA 含量有关。木酯素类化合物可能为其抗焦虑有效成分。

     

    关键词:合欢皮;抗焦虑;机制;水提液;正丁醇部位3

     

    前 言

    焦虑症(Anxiety)又称焦虑性神经官能症,是以广泛和持续发作性焦虑或反复发作性惊恐不安为主要特征的神经性障碍,常伴有自主神经紊乱及运动性不安的病症。根据临床表现将其分为广泛性焦虑(GAD)和惊恐障碍(PD)两种主要形式。

    焦虑症患者常伴有头晕、胸闷、心悸、呼吸急促、口干、出汗等植物神经症状和运动性紧张。焦虑症的发生与多种因素有关,其生化机制与去甲肾上腺素、多巴胺、5-HT、GABA 等多种递质系统有关,GABA 是哺乳类动物脑内最主要的抑制性递质,经典的抗焦虑药物苯二氮卓类,即是通过作用于 GABA 受体的BZ 位点,而发挥抗焦虑作用,5-羟色胺受体基因敲除小鼠对 BZ 类及 GABA受体配基的结合能力下降,并呈现出 BZ 类抵抗性焦虑,可能是由于 5-羟色胺受体功能的失调,引起 GABA 受体的构成与表达水平的异常,结果导致焦虑对 BZ类药物的不敏感性,谷氨酸是中枢神经系统中的兴奋性氨基酸,谷氨酸通过特异性受体 N-甲基 D-天冬氨酸,介导中枢兴奋性过程,研究表明,N-甲基-D-天冬氨酸可能与动物的惊厥与焦虑行为有关,拮抗 N-甲基-D-天冬氨酸可引起噬齿类动物的焦虑效应,谷氨酸和 GABA 作为对脑内主要的兴奋性和抑制性氨基酸递质,二者的比值反应了一定的功能状态。

    西医治疗焦虑症主要根据其类型进行药物干预和心理疏导,但是抗焦虑化学药有着较广泛的不良反应。长期应用抗焦虑化学药可产生头昏、嗜睡、乏力、视物模糊及复视、语言不清、记忆力减退等症状,而且易产生药物依赖性以及停用药物后一系列戒断症状。这一系列不良反应限制了抗焦虑化学药的使用范围。而单纯的心理治疗治愈率并不高,临床上往往将其与药物治疗配合使用。鉴于西医治疗焦虑症存在的一些问题,研究开发安全、有效的中药制剂显得尤为重要。

    中医中并不存在“焦虑症”的说法,从临床症状上来看,焦虑症属于情志病、心病。可能与中医所说的“郁证”、“惊”、“恐”、“惊悸”、“怔忡”、“不寐”、“脏

    燥”、“百合病”等病症相似。基于中医的诊治整体观和辩证施治原则,临床上焦虑症通常辩证分型治疗,临床上通常辩证分型治疗,中医认为,临床焦6虑症有多种辩证分型,按病程可分为肝气郁结型,气郁化火型、痰热上扰型、心脾两虚型、心神不宁型。应用中医药治疗焦虑症时可以根据患者的临床症状加以辩证施治,通过整体调节达到治病的目的,并且能够因时、因地、因人制宜,疗效确切,不良反应小,安全范围广,显示了极大的优势。因此,利用有效的焦虑动物模型做好中药抗焦虑剂的基础药效学研究,遵循中药新制剂开发的一般规律,研制出治疗焦虑症多种证型的高效制剂,将是抗焦虑药物发展的一大趋势。

    中医认为焦虑属心神不宁表现,因此可选用安神类的中药如酸枣仁、合欢皮、远志等进行治疗,合欢皮为豆科植物合欢 Albizzia julibrissin Durazz.的树皮,别名合昏皮(《备急千金药方》)、夜合皮(《独行方》)、合欢木皮(《本草纲目》)。合欢皮入药始载于《神农本草经》。《中国药典》2010 版一部记载合欢皮性平味甘,归心、肝、肺经。解郁安神,活血消肿,用于心神不安忧郁失眠,肺痈、疮肿,跌扑伤痛。 临床上有含合欢皮的复方解郁丸的抗焦虑的相关报道,含有合欢皮的复方养血安神汤在临床使用上也有明显的抗焦虑作用。现代药理研究表明合欢皮一般剂量(10-15g)可解郁安神,起镇静作用,中低剂量合欢皮水煎液可协同戊巴比妥纳缩短睡眠潜伏期及延长睡眠时间(p<o.o1),起镇静催眠作用。本实验拟通过观察合欢皮对焦虑小鼠行为的影响,评价合欢皮的抗焦虑作用,并通过给药后动物脑内γ-氨基丁酸、谷氨酸和 5-羟色胺含量的变化来探究合欢皮抗焦虑的作用机制。

    实验一 合欢皮水提液最佳提取工艺研究

    1 仪器与试剂

    1.1 仪器

    超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司。

    数显恒温水浴锅:上海比朗仪器有限公司;

    循环水式真空泵:巩义市英峪予华仪器厂;

    Waters e2695 型高效液相色谱仪:美国;

    Waters 2489 UV/Visible Detector:美国;

    启天 M7300 工作站:联想公司;

    SZ-93 自动双重蒸馏水:上海银泽仪器设备有限公司:

    Acculab 电子天平:德国赛多利斯科学仪器有限公司

    十万分之一天平:上海海康电子仪器厂;

    1.2 药材与试剂

    合欢皮:豆科植物合欢 Silktree Albizia Bark 的干燥树皮,原产地:湖北,规格:选,产品批号:121228,经河南中医学院生药学教授陈随清教授鉴定确认。质量标准符合《中国药典》2010 年版一部要求。

    对照品:(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷,136997-64-3,四川维克奇公司。

    乙腈:Dikma 公司,色谱纯

    甲醇:天津市凯通化学试剂有限公司,分析纯

    磷酸:天津市登科化学试剂有限公司,色谱纯

    双蒸水:实验室自制

    2 实验方法与结果

    2.1 合欢皮中木酯素含量测定

    2.1.1 对照品溶液的制备:用十万分之一天平精密称取对照 20µg 置于 10ml 容量瓶中,加入 50%甲醇溶解,定容,摇匀,备用。

    2.1.2 供试品溶液的制备 按照药典标准取合欢皮细粉 0.5g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入 50%甲醇 20ml,密塞,称定重量,浸泡 1 小时,超声处理(功率 250w,频率 40kHz)30 分钟,放冷,在称定重量,用 50%甲醇补足够、减失的重量,摇匀,滤过,经 0.45µm 微孔滤膜过滤,取续滤液备用,即得。

    2.1.3 色谱条件:色谱柱 Symmetry○R C18(4.6 mm×250mm,5.0μm),流动相:乙腈-0.04%磷酸水溶液(18:82),流速为 1ml·min-1, 柱温 30℃,分析时间 40min。采用 Waters2489 紫外检测器,检测波长 204nm,进样体积:20µl。在此条件下对照品溶液和供试品溶液分别进样 20µl,进行测定得色谱图 1

    2.1.4 标准曲线的绘制:按照上述色谱条件,取对照品溶液分别进样 2,4,6,8,10ul,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,得到标准曲线,其回归方程:Y=42812X-2316 r=0.9998,线性范围为 0.06-1.06µg。

    2.1.5 精密度试验 取对照品溶液,重复进样 5 次,每次 20ul,测得 SAG 的峰面积,计算 RSD 为 1.3%,说明仪器精密度较好。

    2.1.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液分别在 0,2,4, 8,12h 进样 20ul,在上述色谱条件下进行分析测定,计算含量的 RSD 为 2.5%,结果表明供试品溶液在48h 内稳定性良好。

    2.1.7 加样回收率试验 精密称取 9 份约 0.25g 的药材,3 份为一组,分别精密加入低、中、高 3 个浓度的对照品溶液,按照供试品溶液制备方法操作,进样20ul,在上述色谱条件下进行分析测定,低,中,高 3 个浓度的回收率分别为96.3%,98.8%,100%;RSD 分别为 1.6%,2.2%,1.8%。

    2.1.8 样品含量测定结果 经计算样品中(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D 呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷含量为 0.128%。高于药典所规定的含量不得少于0.030%。

    2.2 合欢皮水提液最佳工艺研究

    2.2.1 色谱条件

    色谱柱为 Symmetry○R C18(4.6 mm×250mm,5.0μm), 流动相:乙腈-0.04%磷酸水溶液(18:82),流速为 1ml·min-1,分析时间 30min。检测波长为 204nm,进样体积为 20μL。流动相在使用前经 0.45μm 微孔滤膜过滤,过滤后进行超声脱气5min。

    2.2.2 标准曲线的制备

    取对照品溶液分别进样 2、4、6、8、10ul,测定峰面积,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,得到标准曲线,其回归方程 Y=42812X-2316 r=0.9998,对照品在 0.06 -1.06µg 范围内成良好的线性关系。

    2.2.3 正交实验设计

    称取合欢皮粉末 50g(粉碎过三号筛)共 9 份,置 1000ml 圆底烧瓶中,按照 L9(34)正交实验表确定的条件以加水量、提取时间、提取次数 3 因素进行提取,过滤,定容至 200ml,备用。

    2.2.4 供试品溶液中丁香树脂酚的含量测定

    供试品溶液的制备

    精密称取正交设计中每份供试品溶液 2ml,置蒸发皿中挥干溶剂,用甲醇溶剂,转移至 50ml 量瓶中,加甲醇定容,摇匀,用 0.45µm 微孔滤膜过滤,精密吸取上述溶液 2ml 至 10ml 量瓶中,定容摇匀,每份进样 20µl。

    从表 2 正交实验结果表明 A、B、C 对合欢皮提取影响程度不同,各因素的影响程度为 C>A>B,其中 C 对提取工艺有显著影响,A 有影响,B 影响不大,合欢皮水提液最佳工艺为:A3B2C2即 10 倍量的水,提取 2 次,每次 1.5h。

    实验二 合欢皮水提液对小鼠抗焦虑作用研究

    1.实验材料

    1.1 实验药品

    合欢皮:豆科植物合欢 Silktree Albizia Bark 的干燥树皮,原产地:湖北,规格:选,产品批号:121228,经河南中医学院生药学教授陈随清教授鉴定确认。质量标准符合《中国药典》2010 年版一部要求。

    地西泮片:购自河南中医学院第三附属医院,天津力生制药股份有限公司,规格:2.5mg。产品批号:1304006

    1.2 实验动物

    KM 小鼠,SPF 级,体重 20±2g,雄性。购自郑州大学医学院动物实验中心,许可证号:SCXK(豫)2010-0002,质量证号:NO.41003100000236。分笼饲养于动物实验中心,温度 20±2℃。

    1.3 主要仪器

    GZX-9070 MBE 电热鼓风干燥箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;

    ZDHW 型调温电热套:河北省黄骅市中兴仪器有限公司;

    HH-6 数显恒温水浴锅:上海比朗仪器有限公司;

    EYELAN-1100旋转蒸发仪:上海爱朗仪器有限公司;

    SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵:巩义市英峪予华仪器厂;

    DZF-6020 型真空干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;

    EL-S 电子天平:常州市天之平仪器设备有限公司;

    Acculab 电子天平:德国赛多利斯科学仪器有限公司;

    KQ3200B 超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;

    XR-XG201高架十字迷宫装置:上海欣软信息科技有限公司;

    XR-XB120小鼠明暗箱装置:上海欣软信息科技有限公司;

    TGL-16gR 型高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂;

    JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机:宁波新芝生物科技股份有限公司;

    微量移液器:北京大龙兴创实验仪器有限公司;

    酶免仪(680 Microplate Reader,Bio-Rad Laboratories);

    γ-氨基丁酸(GABA)检测试剂盒(由 R&D 生产,批号 20131101A);

    谷氨酸( Glu)检测试剂盒(由 R&D 生产,批号 20131101A);

    五羟色胺(5-HT)检测试剂盒(由 R&D 生产,批号 20131101A)。

    氯化钠注射液:河南双鹤华利药业有限公司,产品批号:A12032601

    全自动制冰机:江苏常熟电器厂

    2.实验方法

    2.1 药物制备

    取 50g 合欢皮粉碎,加 10 倍量水浸泡半小时,回流提取 2 次,每次 1.5h,过滤,合并滤液,浓缩至 100ml,

    2.1 分组与给药

    SPF 级别小鼠 60 只,体重体重 20±2g,雄性,不限食水喂养适应环境喂养 3天,第四天称重编号,按随机分组软件随机分为五组,每组 12 只,分别为焦虑模型组,阳性给药组,合欢皮水提液高、中,低剂量组,

    模型组:ig 蒸馏水

    阳性组:ig 地西泮水溶液(2.5mg/kg)

    合欢皮水提液高剂量组:ig 合欢皮水提液(5g/kg)

    合欢皮水提液中剂量组:ig 合欢皮水提液(2.5g/kg)

    合欢皮水提液低剂量组:ig 合欢皮水提液(1.25g/kg)

    每天上午 8:30ig 给药,给药体积 0.1ml/10g,连续 ig 给药 5d.

    2.2 行为学实验

    2.2.1 高架十字迷宫实验

    Ig 给药第 5d,按日常灌胃顺序,每 5min 给药,给药 0.5h 后进行高架十字迷宫实验。实验前先将小鼠置于开场中活动 5min,然后将小鼠置于迷宫中央,使其头部正对其中一个开放臂,用计算机跟踪记录小鼠在高架十字迷宫上的活动情况,记录时间为 5min。以小鼠开臂进入次数百分比(OE%)即开臂进入次数/(开臂进入次数+封臂进入次数)和开臂滞留时间百分比(OT%)即开臂滞留时间/(开臂滞留时间+封臂滞留时间)作为评价药物抗焦虑作用的指标。

    2.2.2 明暗箱实验

    高架十字迷宫实验结束后立即进行明暗箱实验,先使其在安静的环境下自由15活动 5min,然后将小鼠背对暗室置于明室中央,观察记录 10min 内小鼠在明暗箱内的穿箱次数(TT),以此作为评价药物抗焦虑作用的指标。

    整个实验过程中注意保持实验环境的安静和实验装置的清洁从而减少外界环境对实验结果的影响。

    2.3 抗焦虑作用机制研究

    2.3.1 实验方法 小鼠行为学实验结束后,立即断头处死,冰台上迅速剥离全脑,用万分之一天平精密称重,以脑组织(g):生理盐水(mL)=1:4 的比例加入冰冷的生理盐水,低温下用超声波细胞粉碎机进行匀浆,匀浆液在 4℃,8000r/min条件下离心 10min,取上清液置 5mL 离心管中,即得浓度为 20%的小鼠脑匀浆液,取脑匀浆液进行酶联免疫吸附法,分别测定脑组织中 GABA、Glu 和 5-HT 的含量,具体操作严格按照试剂盒说明进行。

    2.3.2 GABA 含量测定

    GABA 试剂盒操作步骤:①将铝箔袋从试剂盒中取出,放置于室内,室温平衡 20min,从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条;②设置 12 个标准品孔和 60 个样本孔及一个空白孔,标准品孔各孔内加不同浓度的标准品 50μL;③样本孔先加待测样本溶液 10μL,再加样本稀释液 40μL;空白孔不加;④除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔均加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃下水浴温育 60min;⑤弃去加入液体,在吸水纸上用力拍干,将每孔加满洗涤液,静置 1min,甩去洗涤液,再在吸水纸上用力拍干,如此反复洗板 5 次;⑥每孔加入底物 A 和底物 B 各 50μL,37℃下避光孵育 15min;⑦每孔加入终止液 50μL,15min 内,在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

    结果判断:绘制标准曲线:在 Excel 工作表中,以标准品浓度作为横坐标,对应吸光度 OD 值作为纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按线性回归曲线方程计算各样本浓度值。最终样本浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数

    以 GABA 标准品浓度作横坐标,对应 OD 值作纵坐标,绘制标准品线性回归曲线,得曲线方程 A=0.2203C+0.1724(R2=0.9972),表明浓度在 0μmol/L~8μmol/L 范围内,浓度与 OD 值呈现良好的线性关系。

    2.3.3 Glu 含量测定

    Glu 试剂盒操作步骤:①将铝箔袋从试剂盒中取出,放置于室内,室温平衡20min,从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条;②设置 12 个标准品孔和60 个样本孔及一个空白孔,标准品孔各孔内加不同浓度的标准品 50μL;③样本孔先加待测样本溶液 10μL,再加样本稀释液 40μL;空白孔不加;④除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔均加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体 100μL,用封板膜封住反应孔,37℃下水浴温育 60min;⑤弃去加入液体,在吸水纸上用17力拍干,将每孔加满洗涤液,静置 1min,甩去洗涤液,再在吸水纸上用力拍干,如此反复洗板 5 次;⑥每孔加入底物 A 和底物 B 各 50μL,37℃下避光孵育 15min;⑦每孔加入终止液 50μL,15min 内,在 450nm 波长处测定各孔的 OD值。

    结果判断:绘制标准曲线:在 Excel 工作表中,以标准品浓度作为横坐标,对应吸光度 OD 值作为纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按线性回归曲线方程计算各样本浓度值。最终样本浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数

    以 Glu 标准品浓度作横坐标,对应吸光度 OD 值作纵坐标,绘制标准品线性回归曲线,得曲线方程 A=0.0411C+0.2061(R2=0.9908),表明浓度在 0mg/L~48mg/L 范围内,浓度与 OD 值呈现良好的线性关系。

    2.3.4 5-HT 含量测定

    5-HT 试剂盒操作步骤:①将铝箔袋从试剂盒中取出,放置于室内,室温平衡 20min,从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条;②设置 12 个标准品孔和 60 个样本孔及一个空白孔,标准品孔各孔内加不同浓度的标准品 50μL;③样本孔先加待测样本溶液 10μL,再加样本稀释液 40μL;空白孔不加;④除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔均加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃下水浴温育 60min;⑤弃去加入液体,在吸水纸上用力拍干,将每孔加满洗涤液,静置 1min,甩去洗涤液,再在吸水纸上用力拍干,如此反复洗板 5 次;⑥每孔加入底物 A 和底物 B 各 50μL,37℃下避光孵育 15min;⑦每孔加入终止液 50μL,15min 内,在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

    结果判断:绘制标准曲线:在 Excel 工作表中,以标准品浓度作为横坐标,对应吸光度 OD 值作为纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按线性回归曲线方程计算各样本浓度值。最终样本浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。以 5-HT 标准品浓度作横坐标,对应吸光度 OD 值作纵坐标,绘制标准品线性回归曲线,得曲线方程 A=0.0092C+0.143(R2

    =0.9925),表明浓度在 0ng/mL~120ng/mL 范围内,浓度与 OD 值呈现良好的线性关系。

    2.4 统计学方法

    采用 SPSS17.0 软件进行单因素方差分析,实验数据以(x—±s)表示;以 P<0.05为差异具有显著性。

    3 结果

    3.1 合欢皮水提液对小鼠焦虑行为的影响

    通过表1及图1可以看出,与焦虑模型组比较,阳性对照组地西泮能增加小鼠进入高架十字迷宫OE%( P<0.05),增加OT%(P<0.05),明显增加TT(P<0.01)表明造模成功;与焦虑模型组比较,阳性地西泮组与合欢皮水提液高剂量组能增加小鼠进入高架十字迷宫 OT%(P<0.05),合欢皮水提液中剂量组能显著增加小鼠进入高架十字迷宫 OT%(P<0.01),阳性地西泮组与合欢皮水提液中剂量组能显著增加小鼠进入高架十字迷宫 OE%(P<0.05),阳性地西泮组与合欢皮水提液各剂量组均能增加小鼠在明暗箱穿箱次数 TT(P<0.05),由此显示出合欢皮中、高剂量水提液对小鼠有一定的抗焦虑作用,尤其以合欢皮水提液中剂量的抗焦虑作用较为明显。

    3.2 合欢皮水提液对行为学实验小鼠脑内 GABA、Glu、5-HT 含量的影响

    由表 1 中可以看出,与焦虑模型组比较,地西泮阳性组与合欢皮水提液中剂量组均可提高小鼠脑内 GABA 含量( P<0.05);与焦虑模型组比较,地西泮阳性组与合欢皮水提液组均可降低小鼠脑内 Glu 含量( P<0.05);与焦虑模型组比较,阳性组可显著降低小鼠脑内 5-HT 含量( P<0.01),合欢皮水提液中剂量组可降低小鼠脑内 5-HT 含量;有结果可知,合欢皮水提液抗焦虑作用机制可能与降低小鼠脑 Glu、5-HT 含量,提高脑内 GABA 含量有关。

    4 小结

    合欢皮水提液中剂量组(2.5mg/kg)与焦虑模型组相比在高架十字迷宫开臂滞留时间百分比(%)(OT%),开臂进入次数百分比(%)(OE%)及穿箱次数上(TT)上均有显著性,合欢皮水提液中剂量组对焦虑小鼠的行为学实验一定的干预作用,有较好的抗焦虑作用。合欢皮水提液抗焦虑作用机制可能与降低小鼠脑 Glu、5-HT 含量,提高脑内 GABA 含量有关。