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    震惊反射实验原理及实验方法

    • 创建时间:2016-10-08 点击数:
    • 运用听觉惊跳反射前抑制方法观察大鼠听觉系统发育过程中听觉敏感度和时间分辨率的改变及两者之间的时间相关性。

    内容

    大鼠听觉发育中听觉敏感度及时间分辨率的变化

    摘要

    目的运用听觉惊跳反射前抑制方法观察大鼠听觉系统发育过程中听觉敏感度和时间分辨率的改变及两者之间的时间相关性。

    方法选用日龄为14.16.18.22.26.30.35天的新生SD大鼠各20只,各日龄大鼠分为2组,每组10只,每个日龄组的大鼠均进行听性脑干反应(ABR)测试和听觉惊跳反射前抑制测试,一组大鼠在测试时标记的背景噪声频率为1- 48 kHz,另一组大鼠的背景噪声频率为8-32 kHz

    结果1.2和 4 kHz ABB阈值在第26天、16和32 kHz ABR阂值在第22天、8和48 kHz ABR阈值在第18天与第35天比较差异无统计学意义(P > 0. 05)因此,生后第26天,大鼠听觉系统各频率已发育完全,听敏度已达到正常成年大鼠的水平听觉惊跳反射前抑制测试表明当背景噪声为8- 32 kHz时,第14天大鼠的间隔阈值为50 ms左右;16.18.22.26天大鼠的间隔阈值为25 ms;第30天大鼠的间隔阂值为15 ms;第35天大鼠的间隔阈值为8 ms。当背景噪声为1-48 kHz时,间隔阈值明显下降(P= 0. 013),第14天大鼠的间隔阂值为25 ms;第16.18天大鼠的间隔阈值为15ms;第22.26.30.35天大鼠的间隔阈值为10 ms但在两种背景噪声下,时间分辨率均在第30天发育成熟。

    结论在大鼠听觉系统发育过程中,时间分辨率的发育落后于听敏度的发育。

    关键词听觉发育;听觉惊跳反射前抑制;时间分辨率;听敏度;大鼠

     

        听觉敏感度即听敏度,是辨别不同频率和强度声音的能力。时间分辨率是听觉系统对声音信号快速变化做出反应的能力,时间分辨率主要通过间隔探测实验来衡量,即测量受试者在一个连续的声音中,探测出一个短暂的无声间隔的能力。一般以能够探测到的最短的无声间隔的时程,即间隔阈值代表听觉系统对时间的分辨能力。动物实验中,以往通常采用电击、饮食剥夺等方法建立条件反射以进行行为学间隔测试,上述方法无法保证测试个体身体状态的一致性从而影响结果的准确性,且相对残酷,已逐渐被淘汰。听觉惊跳反射前抑制试验近来以其简单、无创的优点广为运用。听觉惊跳反射(a--

    coustic startle response, A S R)是指人或动物对突然出现的强烈声音刺激产生的防御性行为反射,表现为突然的面部、颈部和肢体骨骼肌的运动。惊跳反射前抑制(prepulse inhibition, PPI)是指在惊跳刺激(startlestimulus, SS)前适当时间(因此称为前刺激,prepulse

    stimulus, PS)给予一个一定时程和强度的刺激(即不能引起惊跳反射的刺激)抑制惊跳反射,使惊跳反应幅度减小,潜伏期延长的现象。PPI测试可用于观察听觉系统对前刺激处理的能力。

        近期许多学者采用间隔抑制试验,即以镶嵌在背景噪声中的无声间隔( silent gap)作为前刺激来研究受试动物的时域处理能力。不同时程的gap镶嵌在60-75 <dB的背景噪声中,其后大约20100 m s跟随一个惊跳刺激,因为只有当动物感受到gap才能对惊跳反射有明显的抑制作用,因此,可以通过该方法测得受试动物的前刺激抑制率或间隔阈值,从而对受试动物时域处理能力进行研究。

    目前运用gap一PPI测试手段研究大鼠时间分辨率发育与听敏度发育的相关性仍较少。本试验运用gap一PPI及ABR测试研究大鼠听觉时间分辨率和听敏度的发育及其相互关系。在gaP一PPI测试中,以携带不同时程的gaP作为惊跳反射前刺激,研究大鼠听觉系统发育过程中时间分辨率的改变。携带g ap的背景噪声的频率采用大鼠最敏感且发育最早的频率,即8- 32 kHz,并排除扩大的频率带宽对间隔测试的影响。同时也采用1-48 kHz的背景噪声作为对比,观察大鼠发育过程中时间分辨率的变化及带宽对其的影响。另外,为了排除PPI测试的经验效应对间隔阈值的影响,每只大鼠只进行一次gap一PPI测试,报告如下。

    1材料与方法

    1. 1实验材料

    1.1.1实验动物日龄为天的新生SD大鼠各20只14,16,18,22,26,30,35共140只。雌雄不限,耳廓反射正常,耳镜检查排除外耳道盯聆栓塞及中耳感染。

    1. 1. 2实验试剂及仪器盐酸氯胺酮注射液,2%盐酸利多卡因注射液。上海欣软震惊反射实验分析系统

    1. 2实验方法

    1. 2. 1各日龄实验大鼠随机分为A,B两组,每组10只。A组大鼠gaP一PPI测试标记gaP的背景噪声带宽为1- 48 kHz, B组大鼠的背景噪声带宽为8 - 32kHz,背景噪声的强度均为75 dB SPL。各日龄的两组大鼠均先进行ABR测试,然后进行gap一PPI测试。

    1.2.2 ABR测试所有刺激信号的产生和诱发电位的记录均由TDT  system 3系统硬件和软件完成。ABR阂值为1-48 kHz范围内各倍频程点短纯音的响应阂值。短纯音上升、下降时间为0. 5 ms,时程为10 ms,刺激重复率为11. 1次/秒。大鼠经盐酸氯胺酮肌肉注射麻醉后置于恒温电热毯上,保证大鼠体温稳定在37. 5℃左右,1%利多卡因于大鼠的颅顶及两侧乳突皮下局部注射,记录电极刺入颅顶皮下,参考及接地电极分别刺入左、右侧乳突皮下。刺激声从90 dB SPL开始5 dB下降一档,以刚刚诱发出可辨认的波V的最小声强值为ABR反应阈值。

    1. 2. 3  gap - PPI测试如图1所示,听觉惊跳反射的记录在屏蔽隔声室进行,一次可同时测试多个动物。其主要测试装置为载有敏感压电转换器的铁笼,铁笼大小根据受试动物大小而定,以适度限制动物活动为佳。惊跳刺激信号由震惊反射系统(硬件和软件)完成,并通过悬挂在铁笼上方10cm处的高频扬声器传出。当动物发生惊跳反射时,躯体运动通过垂直力作用于铁笼,经铁笼底部的压电传感器输出信号接入另一个实时处理系统(TDT),经过放大(10一100X)和滤过(10-300 Hz),输入到实时处理器中(RP2.1, TDT), ASR的峰峰值由基于TDT硬件的震惊反射软件计算。在听觉惊跳反射前抑制的记录中,前刺激信号也由震惊反射系统硬件和软件完成,通过悬挂在铁笼上方10cm处的高频扬声器传出,前刺激的听觉惊跳反射(acousticstartle response with prepulse, ASRp)的记录和峰值计算和ASR的记录方法一致。

        在gaP一PPI的记录中,由一个高频扬声器输出惊跳刺激信号,另一个高频扬声器输出背景噪声和过gaP。惊跳刺激信号为115 dB SPL(持续时间20ms,上升/下降时间0. 1 ms),前刺激信号为插入在75 dB SPL背景噪声中的不同时程无声间隔( gaP)其时程分别为0,1,2,4,6,8,10,15,25,50,100 ms,上升/下降时间0 ms, 0 ms的间隔测试为仅有惊跳刺激的测试,反映惊跳反射的基值。实验采用2个不同带宽的背景噪声,分别为1- 48 kHz和8-32kHz。实验间隔为相邻两个惊跳刺激信号之间的间隔,在16-24之间,平均ITI为20 s,以避免前面刺激产生的不应期对后面刺激的影响。另外,随机变化的实验间隔较固定的间隔更少出现惊跳反射的适应性,并可防止动物产生期待情绪。单组实验流程包括:背景噪声一插入gaP一背景噪声一凉跳刺激信号。

    1. 3统计学方法

    所有数据经sigma state统计软件分析。在研究听敏度的发育中,以每组各时间点大鼠各频率段的ABR阈值为自变量,日龄和频率为两个因素,进行双因素方差分析。文献报道大鼠在生后14天ABR才能够引出,到第35天左右,听敏度和成年鼠无差异,所以本实验将35天龄大鼠的ABR作为标准对照。故每个日龄大鼠的ABR阂值均与第35天的ABR阂值比较,有统计学差异表示该日龄大鼠的听敏度尚未发育成熟,无统计学差异则表示该日龄的听敏度已经发育成熟。间隔阈值通过配对t检验,比较各时程的gap(1,2,4,6,8,10,15,25,50,100 ms)引起的A S-Rp与ASR基值(gaP为0 ms)而得,以具有统计学差异的最短gaP为间隔阂值。

    PPI%是ASRp和ASR的比值,可用于比较不同日龄大鼠在间隔探测中的表现。采用双因素方差分析,比较日龄(7个水平,14,16,18,22,26, 30, 35天)和无声间隔(10个水平,1,2,4,6,8,10,15,25,50,100 ms)双因素的作用及可能相互作用,如果发现某一因素的显著性作用后,再用两两比较的方法决定具有显著作用的因素水平。

    2结果

    2. 1日龄增加对间隔阂值的影响图2为两组大鼠在不同背景噪声下的间隔I=}7值。可见,大鼠间隔阈值随日龄增加而下降,表明随着听觉系统的发育,大鼠的时间分辨率增加,时域处理能力增强。另一方面,相对于8-32 kHz的背景噪声,1- 48 kHz背景噪声时的间隔阈值明显下降(P= 0. 013),也证实了随着携带gaP的背景噪声频率带宽的增宽或频率的提高,时间分辨率越佳。

    2. 2日龄增加对PPI%的影响表1结果显示在背景噪声为1- 48 kHz时,第30天大鼠的时间分辨率才发育成熟。当背景噪声为8-32 kHz时,虽然大鼠的间隔阂值提高,但同样到第30天时,时间分辨率才发育成熟。不同日龄在不同背景噪声下大鼠PPI%的变化趋势,gaP时程越长,PPI%越小;日龄增加,PPI%越小。

    2. 3不同日龄大鼠ABR反应阂比较生后14,16,18,22,26,30及35天大鼠的ABR阈值见表201,2和4 kHz频率的ABR阈值第26天与35天无统计学差异;16和32 kHz的ABR阈值第22天与35天无统计学差异;8和48 kHz的ABR阈值第18天与35天无统计学差异。所以到生后第26天,大鼠各频率听敏度已达到正常水平。