二甲双胍改善高脂饮食诱导的大鼠学习记忆障碍论

内容

二甲双胍改善高脂饮食诱导的大鼠学习记忆障碍论 　　

［摘要］ 目的探讨二甲双胍( metformin，MET) 对高脂饮食诱导的大鼠学习记忆障碍的影响。方法 30 只 SD 大鼠，随机分为普通饲料饲养组( Control 组) 和 2 个高脂饲料饲养组( high fat diet，HFD) ，共 4 周，后 2 组中又分为仅用 HFD 组及 HFD + MET 组。MET 浓度为 2 mg/ml，连续给药 4 周后尾尖取血检测大鼠空腹血糖及糖耐量，并测定大鼠焦虑样行为和学习记忆的变化，方法包括高架十字迷宫实验、敞箱实验、水迷宫实验、被动回避实验。结果HFD 导致大鼠糖耐量降低，而 MET 处理可以改善大鼠糖耐量; HFD 与 HFD + MET 处理不影响大鼠的自主活动性，也不诱导大鼠出现焦虑样症状; 在水迷宫实验的探索阶段，相对于 HFD 组，MET + MET 组大鼠穿越平台次数显著增加，第1 次到达平台时间缩短，在目标象限探索时间缩短; 在被动回避实验中，其逃避潜伏期较 HFD 组显著延长，进入暗箱次数减少。结论 MET 对高脂饮食诱导的学习记忆障碍有一定的改善作用。　　

［关键词］高脂饮食; 二甲双胍; 学习; 记忆　　

随着社会经济的发展、人们生活方式的改变及人口老龄化，全球范围内2 型糖尿病( type 2 diabetesmellitus，T2DM) 发病率呈逐年增高的趋势。T2DM是一种慢性代谢障碍疾病，具有遗传易感性，在环境因素的触发下发病，其早期发生与胰岛素抵抗相关。胰岛素抵抗是 T2DM 的重要发病因素，也是T2DM 病理特征之一。T2DM 发生时，胰岛素的靶器官对生理浓度的胰岛素反应减弱，即胰岛素抵抗，此时需要大于正常量的胰岛素才能在胰岛素的效应器官产生正常的生理效应。　　

大量研究表明，T2DM 可以导致认知障碍。Tau 蛋白是一种微管相关蛋白，对微管形成起促进和稳定作用。T2DM 状态下，脑内胰岛素抵抗可引起 Tau 蛋白过度磷酸化，从而导致神经纤维缠结，而神经纤维缠结为阿尔茨海默病( Alzheimer'sdisease，AD) 的主要病理特征之一。此外，脑内胰岛素抵抗引起 Tau 蛋白过度磷酸化，可导致神经细胞骨架破坏，神经细胞功能障碍。胰岛素抵抗还可促使 Aβ 在脑内沉积，加速 AD 的进程和痴呆症状的进展。有研究指出，长期高脂饮食可降低大脑对葡萄糖的摄取，诱导动物模型产生糖耐量降低及胰岛素抵抗。高脂饲料饲养( HFD) 不仅导致外周胰岛素抵抗，亦损伤神经元胰岛素受体功能，从而导致认知障碍。T2DM 导致的认知障碍不容忽视。 二甲双胍( 1，1-dimethylbiguanide hydrochloride，metformn，MET) 是治疗 T2DM 的一线药物，它可以减少肝糖原输出，增加胰岛素调节糖原的作用。以往研究证明，MET 可迅速透过血脑屏障产生如抗炎及神经保护作用。MET 能否改善高脂饮食诱导的认知障碍尚不明确，本研究旨在观察 MET 是否具有改善胰岛素抵抗大鼠学习记忆障碍的作用。　　

1 材料与方法　　

1． 1 动物　　

清洁级成年健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠 30只，体质量 160 ～180 g，由南方医科大学实验动物中心提供。动物合格证号: SCXK( 粤) 2008-0002。　　

1． 2 药品与试剂　　

MET 购自 Sigma 公司，批号 D150959; 高脂饮食配方饲料( 配方代号: D12496) ，由广东省医学实验动物中心提供。　　

1． 3 仪器　　

Morris 水迷宫、旷场与高架十字迷宫装置及Supermaze动物行为学分析系统，为上海欣软信息科技公司产品; One-Touch UltraEasy 血糖仪购自强生公司。　　

1． 4 方法　　

30 只大鼠适应性饲养 3 d，自由饮水进食。按完全随机分组法分为 3 组: 普通饲料饲养组( 正常对照组，Control 组) ，10 只; 另 2 组为 HFD 组，20只，4 周后随机分为 HDF 组( 仅给 HFD) 和 HDF +MET 组( 在给 HFD 同时饮水中加入浓度为 2 mg / mlMET) 。每周监测大鼠体质量变化，MET 处理 4 周后进行行为学测试。　　

1． 4． 1 空腹血糖及糖耐量测定　　

1． 4． 1． 1 空腹血糖测定 大鼠禁食 12 h 后，剪尾尖取血，用血糖仪测量。　　

1． 4． 1． 2 糖耐量测定 大鼠禁食 12 h 后，称量体质量，剪尾采血测空腹血糖值，然后按照 1 g/kg 的剂量腹腔注射葡萄糖，葡萄糖注射后 30、60、90、120min 不同时间点尾尖采血测血糖值。　　

1． 4． 2 旷场实验 旷场由木箱自制，底面为 75 cm ×75 cm 的正方形且被等分为 25 个等边方格，高为40 cm的敞箱，装置由黑色染料涂成。把大鼠放在旷场的中央方格内，观察 5 min 中内大鼠穿越格子数( 四爪均进入方格内方可计数，为水平运动得分) 、后肢直立次数( 两前爪腾空或攀附箱壁，为垂直运动得分) 、粪便粒数。每只大鼠实验完毕用 75% 乙醇清洁敞箱后再进行下一只动物测试。　　

1． 4． 3 高架十字迷宫实验 将大鼠置于迷宫中央，头朝开臂，观察者距离迷宫中心至少 1 m。分别记录实验期( 通常为 5 min) 内大鼠进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间( 进出臂标准应严格界定，以四爪全部入臂或两只前爪出臂为准) 。计算大鼠进入开臂次数和在开臂滞留时间分别占总次数( 进入开臂和闭臂次数之和) 和总时间( 在开臂与闭臂滞留时间之和) 的百分比，以此作为评价焦虑的指标。　　

1． 4． 4 水迷宫实验　　

1． 4． 4． 1 定位航行实验 水迷宫装置包括一个内壁被漆成黑色的圆柱形水池和带有跟踪系统的摄像机，直径 120 cm，高 50 cm，放置一个直径为 10 cm、高 30 cm 的平台，水池水面高出平台 2 cm，池内水温保持在( 23 ± 2) ℃，水池等分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，每个象限中固定 1 个点为入水点，平台放置的象限为目标象限，整个实验中平台位置不变。将大鼠面对池壁，分别从 3 个入水点入水( 平台所在象限的入水点除外) 连续训练5 d，时限设置为每次90 s，平台停留时间20 s，如90 s 内未找到平台，由实验者将其引至平台，潜伏期记为 90 s。动物的行为学表现经影像跟踪系统自动记录，记录大鼠从入水到爬上平台的时间( 逃避潜伏期) 。　　

1． 4． 4． 2 空间探索实验 第 6 天将平台撤去，大鼠从平台对立象限的入水点入水，任其在水中游泳90 s，影像跟踪记录大鼠在平台所在象限探索的时间、路程及轨迹图。　　

1． 4． 5 被动回避实验　　

1． 4． 5． 1 明暗箱训练阶段 将大鼠放入明箱，10 s后将明暗箱之间的门打开。大鼠( 四爪) 完全进入暗箱后，立即将中门关上，并给予一次电击( 50 V 交流电) ，持续2 s。让大鼠在暗箱内停留10 s( 以使动物形成箱与电击之间的关联) ，将大鼠放回笼内。清洁操作箱后进行下一只动物的训练。　　

1． 4． 5． 2 记忆保持测试 电刺激训练 24 h 后，将大鼠放入明箱，中门打开，但不给予电击。记录潜伏期( 大鼠放入明箱始至进入暗箱的时间) 及错误次数( 进入暗箱的次数) 。　　

1． 5 统计学处理　　

实验数据均以 x珋 ± s 表示，采用 SPSS13． 0 软件进行分析。体质量、糖耐量检测及水迷宫的逃避潜伏期采用 SPSS13． 0 软件中的重复测量设计资料的方差分析法，其余数据采用单因素方差分析法( one-way ANOVA) 。经方差齐性检验，若方差齐性则组间两两比较采用 LSD 法; 若方差不齐将采用 DunnettT3 法进行分析。P ＜ 0． 05为显著性差异有统计学意义。柱状图采用 GraphPad Prism 5 软件绘制。　　

2 结果　　

2． 1 大鼠体质量变化　　

实验 1 周后，HFD 组相对于 Control 组的体质量差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。HFD + Met 组 1周后大鼠体质量相对于 HFD 组大鼠显著降低( P ＜0． 05) ，这种效应一直持续到实验结束。见图 1。　　

2． 2 血糖值检测结果　　

Control 组空腹血糖值 ( fasting plasma glucose，FPG) 为( 4． 26 ± 0． 182) mmol / L，HFD 组为( 5． 18 ±0． 159) mmol / L，较 Control 组升高( 图 2A) ，而 HFD +MET 组 FPG 降低，为( 4． 01 ± 0． 157) mmol / L，且差异有统计学意义( P ＜0． 05) 。大鼠注射葡萄糖 30、60 及 90 min 后，HFD 组血糖值 较 Control 组 升 高，差 异 具 有 统 计 学 意 义( P ＜0． 05) ，HFD + MET 组在注射葡萄糖 30、60 min后血糖值较 HFD 组降低( P ＜0． 05) ，而在注射葡萄糖后 90、120 min 后血糖值相对于 HFD 组均有降低的趋势。结果见图 2B。　　

2． 3 旷场实验结果　　

各组大鼠的垂直运动得分和水平运动得分差异均不具有统计学意义( P ＞0．05) ，表明 HFD 及 HFD +MET 两组大鼠自主活动没有受到影响( 图 3) 。　　

2． 4 高架十字迷宫实验结果　　

图 4 为各组大鼠进入开臂次数百分比及开臂滞留时间百分比，各组的两个指标差异均不具有统计学意义( P ＞ 0． 05) 。结果表明，HFD 及 HFD + Met两组均不诱导大鼠产生焦虑样症状。　　

2． 5 Morris 水迷宫实验结果　　

2． 5． 1 逃避潜伏期测试 如图 5A，获得性训练第4 天和第 5 天的结果显示，HFD 组逃避潜伏期较Control 组有延长趋势，而 HFD + MET 组可以逆转其逃避潜伏期的延长。　　

2． 5． 2 探索性实验 第 1 次穿越平台时间: Control组为( 8． 19 ±6． 02) s，HFD 组为( 23． 83 ±6． 45) s，较Control 组显著延长( P ＜ 0． 05) ，而 HFD + MET 组可显著减少第 1 次穿越平台时间，为( 9． 79 ± 3． 34) s( P ＜ 0． 05) ; 对于目标象限探 索 时 间，HFD 组( 6． 67 ±2． 48) s 较 Control 组( 15． 51 ± 1． 12) s 显著缩短( P ＜0． 05) ，而 HFD + MET 组大鼠在目标象限探索时间显著延长( P ＜0． 01) ，为( 21． 48 ±1． 91) s;穿越平台次数: HFD 组( 2． 86 ±0． 67) s 较 Control 组( 3． 89 ±0． 54) s 有减少的趋势，而 HFD + MET 组大鼠穿越平台次数( 4．75 ±0．62) 显著增多( P ＜0．05) 。　　

2． 6 被动回避实验　　

在第 1 天训练阶段，各组大鼠首次进入暗区潜伏期无统计学差异，而第 2 天测试阶段，Control 组进入暗区潜伏期为( 272． 9 ± 27． 1) s，HFD 组为( 116． 17 ± 58． 45) s，较 Control 组显著缩短( P ＜0． 05) ，而 HFD + MET 组进入暗区潜伏期为( 225． 4 ±40． 17) s，有所延长( P ＜ 0． 05) ; HFD 组大鼠进入暗　　

箱次数( 即 Errors) 较 Control 组有增多趋势，HFD +MET 组进入暗箱次数有所减少，但差异不具有统计学意义。结果见图 6。　　

3 讨论　　

本研究采用 HFD 方法诱导大鼠糖耐量减低及胰岛素抵抗，更贴近于现实生活中 T2DM 的发生发展过程，采用 HFD 喂养 8 周后大鼠出现糖耐量减低、胰岛素抵抗，与文献报道一致。　　

研究表明，晚期糖基化终末产物与阿尔兹海默病密切相关，当机体处于高血糖状态时，晚期糖基化终末产物在体内蓄积，对中枢神经系统产生直接毒性作用。而当机体长期处于高血糖状态时，大脑血流量降低，引起认知能力及大脑对信息处理能力下降; 同时，毛细血管基底膜增厚，管腔变窄，血脑屏障功能受损，机体的氧化应激水平升高，最终导致认知障碍。　　

MET 作为 T2DM 的一线药物，研究表明其能降低血浆胆固醇和胰岛素水平，改善外周胰岛素抵抗，降低机体氧化应激水平，改善大脑线粒体功能障碍。其改善认知功能的作用可能是通过改善机体高血糖状态，减少晚期糖基化终末产物的形成，改善大脑血流量及血脑屏障功能，减轻高血糖对中枢神经系统的损伤。　　

MET 口服后可迅速透过血脑屏障，所以其可能作为中枢神经系统的神经保护药物直接发挥作用。AMP 激活蛋白激酶 ( AMPK) 是脂质与糖代谢主要的细胞调节剂，可调节长时程增强。研究发现，MET 可以激活 AMPK，并可能通过激活 AMPK 信号通路而发挥改善学习记忆的作用。近来又有研究表明 MET 可以通过激活 αPKC-CBP 通路，改善神经元功能，促进神经发生。　　

越来越多的研究显示 MET 对中枢神经系统产生重要作用，而且其对认知功能的改善并不是通过单一途径，MET 有望成为治疗神经退行性疾病的潜在药物。本研究证实了MET 改善高脂饮食造成的糖耐量减低和胰岛素抵抗，且增强动物的空间认知能力，为 MET 作为改善学习记忆障碍，尤其是T2DM 伴随认知障碍的治疗药物提供了实验依据。　　

　 　

　 　

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