母婴分离/社会击败应激抑郁症小鼠行为学与中枢神经递质的变化及温阳解郁复方的干预作用

内容

母婴分离/社会击败应激抑郁症小鼠行为学与中枢神经递质的变化及温阳解郁复方的干预作用　　

摘 要: 目的: 建立与验证母婴分离/社会击败应激抑郁症小鼠模型，并研究温阳解郁不同组方对抑郁症的干预效果。方法: 用母婴分离与社会击败应激相结合的方法建立小鼠抑郁症模型，并用温阳解郁不同组方进行干预治疗。通过行为学实验( 强迫游泳、鼠尾悬挂实验) 验证模型，高效液相色谱法检测不同脑区单胺类神经递质的含量。结果: 行为学实验结果表明，母婴分离/社会击败小鼠在强迫游泳与鼠尾悬挂实验中不动时间均明显延长。模型小鼠腹侧被盖核( VTA) 区去甲肾上腺素( NE) 水平明显上升，但未达到显著水平。温阳解郁不同组方均有不同程度的调整作用。结论:从行为学实验的结果看，母婴分离/社会击败模型存在着焦虑、抑郁状态，符合抑郁症模型标准。该模型并不存在神经递质含量的变化，这可能与模型本身的特点有关。　　

关键词: 抑郁症模型; 母婴分离; 社会击败; 行为学; 神经递质　　

抑郁症影响到全球 20% 的人群。其发病机制复杂，至今未明，其中以单胺神经递质异常报道最多。根据素质 －应激假说，在易感性的基础上，经受挫折，即遭受“二次打击”后，可引起机体强烈持久的应激反应，最终可能引起精神障碍性疾病的发生。母婴分离和社会击败应激作为精神障碍疾病的重要发病因素，将这两种应激形式结合塑造出的动物模型，不但符合精神疾病发病的素质 －应激假说，而且更接近临床实际情况。本实验以母婴分离/社会击败应激塑造抑郁症小鼠模型，观察其行为学及不同脑区单胺类神经递质的变化，并对温阳解郁不同组方的干预作用进行研究。　　

1 材料与方法　　

1. 1 母婴分离　　

选用大于 12 周的 C57BL/6J 雌鼠按雌: 雄 = 4: 1雌雄混居。孕鼠待产前转为单笼饲养，分娩后以小鼠出生作为 0 天( P0) ，分别于 P1 ～ P14 进行母婴分离，3h / d。分离时先将母鼠移出，再将幼鼠移至孵育箱中( 30 ～32 ℃) ; 母婴分离结束后，先将幼鼠移回窝内，然后移回母鼠。对照组的幼鼠每天也按上述过程处理，分离时间小于 10 min。　　

1. 2 分组及处理　　

选用 12 ～20 周，体重 24 ～30 g 的 C57BL/6J 雄性小鼠进入实验。先将经过母婴分离的小鼠分为母婴分离/击败组 ( MD) ，温阳组 ( Wenyang) ，解郁组 ( Xi-　　

aoyao) ，温阳解郁组( XSF) ，氟西汀组( Flu) ; 再将体重及月龄相当、未经过母婴分离的小鼠作为正常对照组( Control) 。行为学检测每组 12 只，原位杂交检测每组6 只。　　

将 MD、Wenyang、Xiaoyao、XSF 和 FLU 小鼠分别单独引入至 CD － 1 小鼠笼内，两鼠进行打斗至C57BL /6J 小鼠被击败，5 min 后用透明带孔的有机玻璃板将两鼠隔开，同时保持视觉和嗅觉的威胁接触至次日，每次打斗时更换不同的攻击鼠; Control 小鼠每 2只/笼并隔开，每天拿出并放入 1 次。如此进行 10 d。实验第 11 天起 Wenyang 组灌服二仙汤浸膏混悬液( 2. 4 g/kg) ; Xiaoyao 组灌服逍遥散浸膏混悬液( 2. 7g / kg) ; XSF 组灌服温阳解郁复方浸膏混悬液( 4. 7 g /kg) ; Flu 组灌服氟西汀混悬液( 20 mg / kg) ; MD 和 Con-trol 灌服蒸馏水，灌服量为 0. 1 mL /10 g，共治疗 6 周，结束后进行行为学和其他指标检测。　　

1. 3 药品、仪器及试剂　　

1. 3. 1 药品 温阳解郁复方组成: 巴戟 15g，连翘 12g，郁金 12 g，柴胡 12 g，白术 12 g，茯苓 12 g，当归 12g，白芍 12 g，白芥子 10 g，三棱 10 g，炙甘草 6 g，薄荷 2g; 逍遥散: 柴胡 12 g，白术 12 g，茯苓 12 g，当归 12 g，炙甘草 6 g，薄荷 2 g; 二仙汤: 淫羊藿 15 g，巴戟 15 g。上药饮片均购自同仁堂饮片有限公司，常规煎煮水提，低温真空干燥成干浸膏，粉碎。使用时将中药浸膏粉末按比例混于蒸馏水中备用; 氟西汀胶囊为礼来公司生产。　　

1. 3. 2 仪器 美国 ESA 公司的 5600A 型高效液相色谱系统，包括 8 通道库仑电化学检测器( Model 5600ACoularray Detector － 8 ) ，电 极: ESA Model 6210　　

fourchannel cell，582 型泵，软件: ESA Software Version。Sigma － 3K15 超速低温离心机，NANOpure Diamond 超纯水机，MJ － 300 超 声 波 发 生 器，梅 特 勒 托 利 多XS205DU 十万分之一电子分析天平，KONTES 微量电动匀浆器，小鼠大脑切片不锈钢模具( 冠状 1mm，上海欣软) ，飞鹰保安刀片。　　

1. 3. 3 试剂 去甲肾上腺素( NE) 、多巴胺( DA) 、5 －羟色胺( 5 － HT) 、3，4 － 二羟基苯乙酸( DOPAC) 、高香草酸( HVA) 、5 － 羟基吲哚乙酸( 5 － HIAA) 对照品( Sigma 公司) ; 实验试剂甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。　　

1. 4 行为学检测　　

1. 4. 1 鼠尾悬挂实验 ( TST) 所有动物均提前 10min 进入测试实验室; 测试者握住实验鼠尾根部 1 /3处，缠绕上胶布; 实验鼠尾的胶布另一端缠在铁架上，使实验鼠头向下悬挂，头部距离箱底 15 cm，开始计时; 观察 6 min 内实验动物行为，并记录后 4 min 内小鼠的不动时间。　　

1. 4. 2 强迫游泳实验( FST) 测试者握住实验鼠尾部，将两只小鼠分别放入两个玻璃筒( 高 20 cm，直径18 cm，水深 10 cm) 的水中，开始计时; 小鼠在水中不断游动以逃脱玻璃筒，后逐渐放弃游动，观察 6 min 内实验动物行为，并记录后 4 min 内小鼠的不动时间。　　

1. 5 HPLC － FL 法测定不同脑区 NE、5 － HT、DA 的含量　　

1. 5. 1 组织样品制备 各组小鼠用 1% 戊巴比妥钠腹腔注射进行深度麻醉( 100 mg/kg) ，迅速断头，超净台内冰上取脑，液氮速冻，－ 70 ℃ 保存备用。冻存的脑组织放在干冰预冷的小鼠大脑切片模型中，用保安切片切出各层脑片，参照 George Paxinos( The MouseBrain in Stereotaxic Coordinates，second edition，Academ-ic Press，2001) 用平头 17G 针头扣取蓝斑( LC) 、背侧中缝核( DＲN) 、腹侧被盖核( VTA) 。取出的组织放在离心管中精确称重，快速匀浆，4℃离心15 min，取上清液，过滤待测。离心管中清洗干净，烘干，再次精确称重，两次称重后的差值即为组织的净重。　　

1. 5. 2 色谱条件 色谱柱为 ESA HＲ － 80 ( 4. 6 × 8cm) ; 流动相: 90 mM 磷酸二氢钠，50 mM 柠檬酸，1. 7mM 1 － 辛烷磺酸钠，50 μM EDTA，10% 乙腈，pH 约3. 00; 流速: 0. 6 mL / min; 进样量: 20 μL; 柱温: 30 ℃ ;设置 4 道电势为: －150、200、350、500 mV。　　

1. 5. 3 标准曲线 用 NE、DOPAC、DA、5 － HIAA、HVA、5 － HT 标准液及内标 DHBA 标准液稀释成 320、160、80、40、20、10、5 μg / L7 个不同浓度，依次测定后以对照品峰面积比内标峰面积，对浓度进行线性回归并计算相关系数 r2。得出回归方程。由 ESA 软件自动计算出各物质含量的检测值。　　

1. 5. 4 结果计算公式 由 ESA 软件自动计算出各物质含量的检测值。　　

1. 6 统计方法　　

数据表以均值 ± 标准差(珋x ± s) 表示，运用 SPSS11. 0 软件，对数据进行正态分布检验和方差齐性检验，若两项检验均符合，则采用单因素方差分析( One－ way ANOVA) 进行统计学处理，组间比较采用LSD －t 检验; 对不满足任一检验的数据，采用非参数统计中的多个独立样本 Kruskal － Wallis H 检验进行统计处理，组间比较采用 Mann Whitney U 法进行检验，均以 P＜ 0. 05 作为差异有统计学意义的界限。　　

2 结 果　　

2. 1 行为学结果　　

鼠尾悬挂实验( TST) 结果表明，MD 小鼠 TST 实验中不动时间有所延长，但未达到显著水平( P ＞0. 05) ，各治疗组以 Wenyang 组和 XSF 组有减少不动时间的趋势; 强迫游泳实验结果显示: MD 模型小鼠强迫游泳不动时间有所延长( P ＞0. 05) ，XSF 可显著缩短强迫游泳不动时间( P ＜0. 05) ，余组未见明显效果。见表1。　　

2. 2 HPLC － FL 检测结果　　

背侧中缝核( DＲN) 是大脑内 5 － HT 的主要合成核团，蓝斑 ( LC) 是 NE 的合成场所，腹侧被盖核( VTA) 是 DA 的合成核团，这些神经递质合成后向整个大脑布散，发挥着兴奋传导的功能，NE、5 － HT、DA均属单胺类神经递质，与兴奋性神经传导关系密切。分别测取的几个核团神经递质来看，除 VTA NE 水平在 MD 小鼠升高，各治疗组均有所下调外，其它指标均无明显变化，见表 2。　　

3 讨 论　　

3. 1 母婴分离 / 社会击败抑郁症模型评价行为学异常变化是抑郁症患者最主要的变化和诊断依据，行为学评价也是判断抑郁症动物模型和药物效果的主要方法。研究已经发现，短期的母婴分离( 15min) 可以降低应激后下丘脑 － 垂体 － 肾上腺( HPA) 轴反应，减少焦虑行为。而长时间重复的母婴分离恰恰得出了相反的结果，出现了类似抑郁表现。由于延长母婴分离可以作为抑郁易感性的动物模型进行研究，这引起了众多学者的注意，进行了广泛而深入的研究。　　

前期实验中，验证了母婴分离/社会击败模型小鼠在旷场实验中中央区进入次数及停留时间较对照组显著减少; 高架十字迷宫实验中开放臂进入次数及臂停留时间上明显降低，而闭合臂停留时间显著增多; 趋向与回避抉择反应中，模型小鼠趋向抉择时间显著延长。说明模型小鼠的活动显著被抑制、本能动机明显下降，呈现典型抑郁表现。　　

从行为学实验的结果看，MD 小鼠在鼠尾悬挂和强迫游泳实验中，不动时间均明显延长，结合前期行为学实验结果，综合说明该模型存在着焦虑、抑郁状态。在运动实验中，XSF 较温阳与解郁方单独使用减少不动时间的效果更好，提示温阳解郁复方能提高小鼠运动的动机，改善焦虑行为，可能是温阳和解郁互相配合的结果。　　

3. 2 母婴分离 / 社会击败对神经递质的影响抑郁症的发病机制尚未清楚，中枢内单胺类神经递质水平下降假说是抑郁症发病的主要假说，单胺类神经递质包括去甲肾上腺素( NE) 、多巴胺( DA) 和 5－ 羟色胺( 5 － HT) ，分别合成的核团有蓝斑( LC) 、腹侧被盖核( VTA) 、背侧中缝核( DＲN) 。　　

5 － HT 是体内很重要的一种神经递质，可影响多种生理活动和行为。当机体受到心理、生理等各种应激时可伴随有脑内 5 － HT 合成及代谢的改变。大量证据支持 5 － HT 能神经传递降低与抑郁症有关。通过快速耗竭色氨酸来降低 5 － HT 合成，可导致 50% ～80% 抑郁症患者复发，并且可以降低正常心境。　　

20 世纪 60 年代起，情感性精神障碍的儿茶酚胺学说风行一时，认为抑郁症是由于脑内儿茶酚胺，尤其是 NE 的缺乏或相对不足所致，并从单胺氧化酶抑制剂( MAOI) 的药理作用———增高突触间隙的 NE 含量以消除抑郁症状加以证实。有研究报告，抑郁症病人的下丘脑 NE 浓度降低，提示抑郁症与中枢 NE 能低下相关联。但目前在学术界也仍存在着分歧，许多研究表明抑郁症患者 NE 含量与对照组的差异无统计学意义，也有大量研究显示抑郁症病人外周血浆 NE 水平明显高于正常人。　　

　　

本实验中，MD 小鼠 VTA NE 含量增高，5 － HT 与DA 水平未见明显变化，这与以往的单胺递质含量下降不同，说明该模型并不存在着神经递质含量的变化，这可能与模型本身的特点有关。也可能是神经可塑造性变化引起。抗抑郁剂效应延迟暗示边缘系统单胺能神经可塑性改变，童年期虐待和缺乏关怀引起成年抑郁症也提示了神经环路可塑性的改变在抑郁症发病机理起着重要的作用。神经可塑性的变化使情绪大脑的神经环路发生变化，有的脑区功能增强，有的脑区功能下降，从而使情绪产生的偏向性。对抑郁症来说，杏仁核功能的增强使对劣性刺激和不明刺激的检测灵敏度提高，目标评价功能受到抑制，从而导致退缩回避的策略，情绪发生上应偏向抑郁。因此，下一步实验会围绕抑郁症模型神经可塑性的变化进行。　　

　 　

　 　

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