清风胶囊对反复吗啡依赖和戒断大鼠焦虑行为及脑内单胺神经递质水平的影响

内容

清风胶囊对反复吗啡依赖和戒断大鼠焦虑行为及脑内单胺神经递质水平的影响　　

摘 要 目的:探讨清风胶囊对反复吗啡依赖和戒断引起的大鼠焦虑行为和脑内单胺递质的影响。方法: 复制吗啡依赖大鼠成瘾和催促戒断后焦虑模型。将大鼠随机分空白对照组、吗啡模型组、清风胶囊低、中、高剂量组和阳性药地西泮对照组。清风胶囊低、中、高组给药剂量分别为 0． 5，1． 0，2． 0 g/kg，连续给药 5 天。观察动物焦虑行为的改变，并采用荧光分光光度计检测受试大鼠下丘脑单胺类神经递质去甲肾上腺素( NE) 、5-羟色胺( 5-HT) 和多巴胺( DA) 的含量。结果: 清风胶囊 0．5g/kg，1． 0g/kg，2． 0 g/kg 三剂量均能明显缓解吗啡依赖大鼠由于反复躯体依赖和戒断所导致的焦虑行为，并显著减少大鼠下丘脑单胺类神经递质 NE、5-HT 和 DA 的含量。清风胶囊 0． 5，1． 0，2． 0 g / kg 三剂量对大鼠焦虑行为的抑制作用与地西泮比较无明显差异，三剂量组之间亦无明显差异。结论: 清风胶囊 0．5g/kg，1． 0g/kg，2． 0 g/kg 三剂量均对反复吗啡依赖大鼠戒断后的焦虑行为有明显的治疗效果。　　

关键词 清风胶囊; 吗啡依赖; 成瘾；高架十字迷宫　　

清风胶囊由人参、青风藤等药材经提取加工而成，具有解毒祛瘀、益气补血、安神定志的功用，主要用于治疗阿片类药物依赖患者的稽延性戒断症。本实验在吗啡依赖大鼠反复成瘾戒断的基础上引入高架十字迷宫模型，制作反复吗啡依赖大鼠催促戒断后焦虑模型，观察清风胶囊对吗啡依赖大鼠催促戒断导致的焦虑行为的治疗作用，评价该药物对吗啡依赖戒断后焦虑症状的治疗作用，为清风胶囊进一步应用于临床提供理论基础和药理学依据。　　

1 材料与方法　　

1． 1 试验药物 清风胶囊，东方药林药业有限公司生产，批号:100202，0． 45g / 粒。取出清风胶囊药粉，以蒸馏水将药物溶解后配制成实验所需浓度的药液，4℃保存备用，用时充分摇匀。地西泮( DZP) ，2． 5mg/片，广东三才药业有限公司生产，批号0605028。取地西泮片，置研钵中研磨成细粉后以蒸馏水溶解，加入 2%羧甲基纤维素钠 1 ～ 2 滴充分混匀，配成 0． 1mg/ml 浓度。4℃保存，使用前混摇均匀。　　

1． 2 动物 SPF 级雄性 SD 大鼠 60 只，体重 180 ～ 220g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号: SCXK 粤 2011-0015，检疫后备用。实验前全部大鼠适应性喂养 3d，室温 22 ～ 26℃，相对湿度 65%，明暗交替 12h，自由饮水，标准饲料自由采食，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。　　

1． 3 试剂 盐酸吗啡( 药粉) ，解放军总后勤部药材供应站提供，批号: 710303。5-羟色胺，去甲肾上腺素及多巴胺标准品，均为 Fluka 产品。　　

1． 4 仪器 高架十字迷宫: 木质结构，按照国际通用标准复制。迷宫由两个相对的开放臂( open arm，长 × 宽分别为 50cm ×10cm) 、两个相对的封闭臂( close arm，长 × 宽 × 高分别为( 50cm× 10cm × 40cm) 、一个连接四只臂的中央平台( central platform，10cm ×10cm) ( 即: 开放臂-中央平台-开放臂或封闭臂-中央平台-封闭臂，此二者互相垂直成为" + "形状) 和围绕在开放臂边缘的 1cm 高的矮挡板组成，迷宫底板距地面 50cm。迷宫四个臂及中央平台底面均漆成黑色。Ｒf-5301 荧光分光光度计，日本岛津产品。　　

1． 5 方法 取大鼠 60 只、随机分为 6 组，即空白对照组、吗啡模型组、清风胶囊高、中、低剂量组和地西泮对照组。按剂量递增法复制吗啡依赖大鼠模型，给药时间为每天 8: 00 和 20: 00，给药剂量由每次 10mg/kg 递增至每次 80mg/kg，共给吗啡 5 天，空白对照组腹腔注射等体积生理盐水。各组大鼠于末次给吗啡后12 小时，腹腔注射纳洛酮 4． 0mg/kg 进行催促戒断，并记录15min 内动物出现的戒断症状。第 6 ～ 20 天，停用吗啡，动物自由进食和饮水。第 21 ～ 25 天进行第二次吗啡依赖戒断，再次腹腔注射盐酸吗啡，给药时间和剂量同上，空白对照组腹腔注射等体积生理盐水。各组于末次给药后 12 小时，腹腔注射纳洛酮 4．0mg/kg 催促戒断，记录 30 min 内动物出现的戒断症状。通过催促戒断实验被确认为吗啡反复成瘾大鼠，再接受迷宫试验，以戒断症状评分及迷宫实验结果判断吗啡依赖复吸大鼠焦虑模型是否成功。符合焦虑条件的大鼠即可进行后续试验。于实验的第 26 天，阳性药对照组给予地西泮 1mg/kg，一次/d，清风胶囊低、中、高剂量组分别按 0． 5，1． 0，2． 0 g/kg 灌胃给药，连续给药 5 天，空白对照组和吗啡模型组给予等体积生理盐水。　　

1． 5． 1 大鼠焦虑行为测试 测试时间: 于注射吗啡( 造模) 前、第一次纳洛酮催瘾后 8 小时、第二次纳洛酮催瘾后 8 小时、给清风胶囊或地西泮治疗末次给药后 24 小时，共进行四次大鼠迷宫行为学测试。测试条件: 实验室内光线昏暗( 以 1． 5m 距离处能区分大鼠细微活动的最低亮度为准) 并保持恒亮，室温 24℃ 左右，保持安静。在距离测试箱 1． 5m 处观察记录动物的活动。测试指标: 迷宫测试前将每只大鼠放入一敞箱中，任其自由探究5 min 后迅速置于迷宫的中央平台处，使其头部正对其中一个开放臂，释放后即开始记录下述指标① 进入开放臂次数( openarm entry，OE) ; ② 进入开放臂时间( open arm time，OT) ，单位:秒( s) ; ③ 进入封闭臂次数( close arm entry，CE) ; ④进入封闭臂时间( close arm time，CT) ，单位: 秒( s) 。进入到任一封闭臂或开放臂的次数以大鼠四个爪子均进入到臂内为准，四个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成。最后由① ～ ④分别计算出大鼠进入开放臂和封闭臂的总次数( OE + CE) ，表示大鼠的运动活力( locomotor activity) ，大鼠在开放臂和封闭臂停留的总时间( OT + CT) ; 大鼠进入开放臂次数占进入两臂总次数的百分比( OE%) : 即 OE/ ( OE + CE) ×100 %; 大鼠在开放臂停留时间占在两臂总时间的百分比( OT%) ，即 OT / ( OT + CT)× 100 % 。每只大鼠测试 5min。中间用湿布擦拭迷宫，清除粪便，继用干布擦净后再进行下一只大鼠的测试。最后一次迷宫测定完毕，将大鼠取出并迅速断头处死，剥出全脑，放入液氮中快速冰冻，然后放置于-70℃低温冰箱中保存。　　

1． 5． 2 大鼠下丘脑单胺神经递质的测定 取出冰冻保存的大鼠脑组织，放入预先冰冷的生理盐水中，去除脑膜及血管，取下丘脑称重，然后将脑组织转置于含有少量冰冷的酸化正丁醇的匀浆器中，在冰水中制成匀浆。将脑匀浆全部移入具有塞和刻度的离心管内，并用酸化正丁醇补充到 4． 0 ml，经机械振荡 5min，离心 5 min( 3000 rpm) 后，取上清 2． 5 ml 放入另一具塞的离心管内，加正庚烷 5．0 ml 和0． 1 N HCl 1． 2 ml，振荡 5 min，离心 3000 rpm × 5 min，从水相层中分别吸取 0． 5 ml 于两支试管内，用于 5-HT，NE 和 DA 的测定。操作步骤按参考文献的方法进行。NE 于 λEX: 365 nm，λEM: 480 nm 处测荧光值; 5-HT 于λEX: 365 nm，λEM: 480 nm 处测荧光值; DA 于 λEX: 310 nm，λEM: 370 nm 处测荧光值。　　

2 结果　　

2． 1 吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断模型的评价 正常大鼠注射纳洛酮后，未见明显的戒断症状，偶有个别大鼠有刻板动作等。大鼠经吗啡处理 5 天后，再经纳洛酮催促，出现明显的戒断症状，各造模组与未使用吗啡的空白对照组比较，有非常显著性差异。本实验大鼠反复经吗啡处理，两次纳洛酮催促的断症状均十分明显，各组大鼠纳洛酮催促戒断症状评分值见表 1。　　

2． 2 吗啡依赖大鼠催促戒断后焦虑模型的评价 结果如表 2所示，空白对照组大鼠在各测试时间测定的入臂总次数( 进入开臂与闭臂次数之和) 无明显变化。大鼠进入开臂的次数百分率( OE%) 随时间延长而明显增多，第 2 次戒断后及药物治疗后测定的OE% 值与造模前比较，差异显著。模型组大鼠在第 1、2次戒断后测定的入臂总次数较造模前明显减少。但在药物治疗后检测点大鼠入臂总次数较造模前无明显差异。大鼠进入开臂的次数百分率( OE%) 随时间延长而明显减少，第 1、2 次戒断后及药物治疗后测定的 OE% 值与造模前比较均有显著性差异。　　

2． 3 药物对大鼠进入高架十字迷宫开臂次数百分率( OE% ) 的影响 结果如表 3 所示，造模前各组大鼠进入开臂的次数百分率无显著性差异。大鼠反复经吗啡处理后再经纳洛酮催促戒断，进入高架十字迷宫开臂的次数显著较空白对照组减少，各造模组与空白对照组比较，均有显著性差异。经药物治疗后，地西泮组和清风胶囊 0．5g/kg，1． 0g/kg，2． 0 g/kg 三剂量组大鼠进入开臂的次数均增加，与空白对照组比较无显著性意义。未经药物治疗的模型组大鼠与空白对照组仍有明显差异。清风胶囊高剂量组与模型对照组也有显著性差别。清风胶囊 0． 5g/kg，1． 0g / kg，2． 0 g / kg 三剂量组与地西泮对照组之间未见明显差别。清风胶囊三剂量组之间亦无显著性差异。　　

2． 4 药 物对大鼠在高架十字迷宫开臂的停留时间百分率( OT%) 的影响 结果如表 4 所示，造模前各组大鼠进入开臂的时间百分率无显著性差异，大鼠经反复吗啡处理和纳洛酮催促戒断后，进入高架十字迷宫开臂的时间显著较空白对照组减少，各造模组与空白对照组比较均有非常显著性差异。经药物治疗后，地西泮组和清风胶囊高、中剂量组大鼠进入开臂的时间均增加，与模型对照组，均有显著性差异。与空白对照组比较无显著性意义。模型组和清风胶囊低剂量组与空白对照组仍有明显差异。清风胶囊 0．5g/kg，1． 0g/kg，2． 0 g/kg 三剂量组与地西泮对照组之间未见明显差别。清风胶囊三剂量组之间亦无显著性差异。　　

2． 5 药物焦虑模型大鼠下丘脑单胺类神经递质的影响 结果如表 5 所示，模型组大鼠下丘脑去甲肾上腺素( NE) 、5 羟色胺( 5-HT) 和多巴胺( DA) 的含量均明显增多，与空白对照组比较均有非常明显差别。给予不同剂量清风胶囊治疗 5 天后，大鼠下丘脑的单胺递质含量均明显减少，与空白对照组无显著差异。与模型组比较，除低剂量组 NE 无明显差异外，其余各组均有显著性差别。但清风胶囊 0． 5g/kg，1．0g/kg，2． 0 g/kg 三剂量组之间则无明显差异。而给地西泮的阳性对照组大鼠下丘脑 NE和 5-HT 含量明显低于模型组，差异显著。但 DA 水平无明显减少，与模型组比较无显著性差异。清风胶囊 0． 5g/kg，1． 0g/kg，2． 0 g / kg 三个剂量组与阳性对照组比较，亦无显著性差异。　　

3 讨论　　

本实验大鼠经两次吗啡处理并经纳洛酮催促，均出现显著的戒断症状。同时造模大鼠在高架十字迷宫上表现明显的焦虑行为，表明反复吗啡依赖催促戒断大鼠焦虑模型复制成功。该模型大鼠的焦虑行为主要由于反复的躯体依赖戒断所致。实验发现，随测试时间延长，空白对照组大鼠的 OE% 值也明显增大，但大鼠的入臂总次数无明显改变，这表明正常大鼠经多次迷宫测试后可产生适应性的改变。与空白组大鼠相反，吗啡依赖大鼠经纳洛酮催促戒断后，随测试时间延长，OE% 值呈明显减小趋势。大鼠的入臂总次数在第 1、2 次催促戒断时明显减少，表明此时大鼠的焦虑行为尚不明显。但停用吗啡 5 天后，模型组未经任何药物处理，大鼠 OE% 值呈明显减小，同时大鼠的入臂总次数与造模前无明显差异，符合焦虑模型标准，即不改变动物的入臂总次数，减少动物的 OE% 值。清风胶囊 0． 5g/kg，1． 0g / kg，2． 0 g / kg 三剂量连续给药 5 天，可使大鼠进入高架十字迷宫开臂的次数增加，进入开臂的时间也明显延长，表明清风胶囊对吗啡依赖戒断大鼠的焦虑行为具有一定的缓解作用。另外，模型组大鼠下丘脑NE、5-HT、DA 水平明显升高，清风胶囊治疗 5 天后，能使造模大鼠下丘脑内单胺神经递质明显减少。清风胶囊 0． 5g/kg，1． 0g/kg，2． 0 g/kg 三剂量组之间无显著性差异。本研究表明，清风胶囊对反复吗啡依赖大鼠戒断后的焦虑行为有明显的治疗效果，且作用不呈现剂量依赖现象。