Impact factor: 7.9（2024）

Published online：2024-3-1 

研究背景

结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见癌症，许多CRC患者因晚期诊断和治疗效果不佳而死于该疾病，因此迫切需要新的治疗方法。

NSUN2是一种重要的RNA甲基转移酶，催化5-甲基胞嘧啶（m5C）形成，与RNA成熟、编辑、定位、稳定性和翻译有关。

SKIL是转化生长因子-β（TGF-β）信号通路的负调控因子，其在肿瘤发生中的作用复杂，既有促进肿瘤发生（非小细胞肺癌、乳腺癌）、也有抑制肿瘤发生（食管鳞状细胞癌）的研究报道。

NSUN2及SKIL在CRC中的作用及其分子机制尚不清楚。因此，本研究通过控制变量法敲低/过表达NSUN2基因及SKIL基因进行体内外实验，探究NSUN2-SKIL轴及相关靶点对CRC进展的影响。 

研究结果

1.NSUN2在CRC中过表达与患者不良预后相关 

通过数据库对比发现NSUN2在CRC组织中的表达水平显著高于正常组织（图A），在临床CRC样本中也发现了NSUN2的过表达（图B、C），NSUN2高表达CRC患者的总生存期低于NSUN2低表达患者（图D）。 

研究者使用Nsun2敲除小鼠（NSUN2-/-）及正常小鼠（NSUN2+/+），通过化学诱导方式构建CRC模型【图E，首次腹膜内给药（10mg/kg）的偶氮甲烷（AOM），在经过三个六天周期的口服给药2%或1.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）】。与NSUN2+/+小鼠对比，NSUN2-/-小鼠体内CRC肿瘤体积和数量显著下降（图1F~H）；HE染色结果显示，NSUN2+/+小鼠CRC肿瘤的病理分期处于较晚期阶段（图I）。 

2.NSUN2促进CRC在体内外的恶性进展 

研究者使用干扰病毒（shNSUN2#1、shNSUN2#2）构建稳定敲低NSUN2的CRC细胞系(DLD1、HCT116），使用干扰病毒（PLVX Puro）构建稳定过表达NSUN2的CRC细胞系（PKO、SW480）。结果显示敲低NSUN2会使CRC细胞增殖受到抑制（图A）；过表达NSUN2促进CRC细胞增殖（图B）；向稳定敲低NSUN2的CRC细胞系中引入NSUN2可挽救CRC细胞的生长（图C）。 

过表达NSUN2显著增加了CRC细胞的克隆形成数量（图D～F）、提高了细胞迁徙能力（图G～I）。 

研究者使用稳定敲低NSUN2的CRC细胞（DLD1）构建细胞系异种移植模型（Cell derived xenograft, CDX)。与对照组相比，NSUN2敲低组的肿瘤大小和重量显著降低，并且可以通过引入NSUN2来挽救（图J-L）。 

3.CRC中NSUN2和SKIL表达呈正相关 

为研究NSUN2促进CRC进展的机制，对NSUN2敲低或过表达CRC细胞进行免疫荧光试验，结果表明m5C荧光信号强度与NSUN2表达相关（图A、B），表明CRC细胞中NSUN2具有m5C修饰。

 研究者使用RNA测序和亚硫酸氢盐测序（RNA-BisSeq）技术评估参与NSUN2介导的CRC进展的潜在靶点，筛选出14个重叠的靶点（图C），并通过不同的细胞系进行表达验证，结果发现敲低NSUN2后，只有SKIL表达水平持续降低（图D）；NSUN2过表达的CRC肿瘤组织中SKIL表达水平增加（图E）。 

通过数据库对比分析和临床新鲜样本基因组测序，结果均表明SKIL在CRC中上调（图F），且高表达SKIL与患者不良预后相关（图G）；NSUN2高表达的肿瘤组织中SKIL表达水平也高（图H，I）；免疫组化结果显示NUSN2和SKIL在临床上显示出显著的正相关（图J，K）。 

4.NSUN2在体内外通过SKIL促进CRC恶性进展 

研究者发现在NSUN2敲低的CRC细胞系中过表达SKIL，可逆转NSUN2敲低对CRC细胞增殖、集落形成和迁移的抑制作用（图A~C）。 

使用敲低NSUN2（shNSUN2）或高表达（PLVX-SKIL）的DLD1细胞系构建CDX模型，结果表明敲低NSUN2抑制了肿瘤生长，降低了肿瘤重量和Ki67表达水平，而SKIL过表达可逆转这些影响（图D-G）。 

5.NSUN2以YBX1依赖性方式调节SKIL表达 

为了探索NSUN2的致癌功能是否取决于其甲基转移酶活性。研究者在271和321位半胱氨酸引入点突变，生成没有甲基转移酶活性的NSUN2蛋白。通过在NSUN2沉默细胞中过表达野生型NSUN2和突变型NSUN2，结果发现只有野生型NSUN2能够挽救CRC细胞增殖、集落形成能力（图A）和SKIL mRNA、蛋白质水平（图B）。 

研究者发现SKIL mRNA存在区域的m5C抗体高度集中。此外，沉默NSUN2降低了CRC细胞中SKIL的m5C水平，但可以通过过表达野生型NSUN2来挽救。由于m5C修饰可以调节靶标mRNA的稳定性，研究者使用放线菌素D（阻断新RNA合成）处理CRC细胞并通过定量PCR评估靶标mRNA的半衰期。结果显示NSUN2沉默显著降低了SKIL mRNA的半衰期（图E），可以通过表达野生型NSUN2来恢复（图F），表明NSUN2通过m5C修饰增强SKIL mRNA稳定性来上调其表达量。 

Y-box结合蛋白1（Y-box binding protein 1 ，YBX1）可识别mRNA的m5C修饰，研究者发现YBX1可以与SKIL mRNA结合（图G），并且这种相互作用在NSUN2沉默细胞中减少（图H），表明YBX1可能识别SKIL的m5C修饰。 

研究者进一步敲低YBX1，结果发现敲低YBX1可以通过降低CRC细胞中SKIL mRNA的半衰期来降低SKIL的表达水平（图I，J）；敲低YBX1抑制了NSUN2激活SKIL表达（图K，L）。 

6.NSUN2通过SKIL-TAZ轴促进CRC肿瘤进展 

YAP/TAZ是转录共激活因子，有研究表明SKIL通过增强TAZ的活性促进乳腺癌进展。在本研究中，发现过表达NSUN2增加了TAZ蛋白水平，而NSUN2敲低抑制了TAZ表达（图A、B）；SKIL过表达部分恢复了NSUN2沉默细胞中TAZ表达及其靶标的激活（图E、F），表明NSUN2可调节SKIL-TAZ轴。

研究者通过构建CRC患者异种移植模型（Patient-derived tumor xenograft model，PDX)并在小鼠腹膜内注射维替泊芬（YAP/TAZ抑制剂，图H），进一步在体内鉴定NSUN2可调节SKIL-TAZ轴。

结果发现，维替泊芬的给药减轻了高表达NSUN2（病例1和2）荷瘤小鼠的肿瘤进展；维替泊芬对低表达NSUN2（病例3和4）荷瘤小鼠的肿瘤的生长和体重影响较小（图I、J）。 

综上，NSUN2通过促进SKIL mRNA稳定和TAZ激活来促进CRC恶性进展。 

结论

本研究发现NSUN2通过催化形成m5C修饰，增强SKIL mRNA的稳定性，这一过程依赖于YBX1的表达调节；NSUN2与SKIL的表达呈正相关，提高的SKIL表达水平可增加转录共激活因子TAZ的表达从而推动CRC进展。

本研究揭示了NSUN2在CRC中的分子机制，也为开发新的治疗方法提供了可能的分子靶点。 

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。  

REFERENCE：Zou S, Huang Y, Yang Z, Zhang J, Meng M, Zhang Y, Feng J, Sun R, Li W, Wang W, López JG, Fang L. NSUN2 promotes colorectal cancer progression by enhancing SKIL mRNA stabilization. Clin Transl Med. 2024 Mar;14(3):e1621. doi: 10.1002/ctm2.1621. PMID: 38468490; PMCID: PMC10928349.