Impact factor: 7.9（2024）

Published online：2024-1-6 

研究背景

包括乳腺癌在内的大多数实体肿瘤具有肿瘤内部异质性特征（体现为肿瘤内部细胞群体在遗传、表观遗传、转录组或表型特征上的差异性），将其作为同质性疾病进行治疗（例如使用ER 拮抗剂治疗ER+乳腺癌）容易导致肿瘤内预先存在的耐药细胞的扩增，从而导致治疗抗性产生。了解肿瘤内异质性对于癌症诊断、治疗和预后评估至关重要。

空间转录组学（Spatial Transcriptomics，ST）是一种以空间的维度分析和描述特定细胞类型的表达谱，它能够解析组织在不同空间位置的转录本情况，但其分辨率有限。单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种在单细胞水平上利用RNA测序对特细胞群体进行基因表达谱定量的高通量实验技术，分辨率高但无法展示空间信息。ST和scRNA-seq技术的结合应用可以弥补相互的不足。

为了解ER+乳腺癌肿瘤内部异质性，研究者通过ST和scRNA-seq技术探究了ER+乳腺癌患者源性异种移植（Patient-Derived Xenograft，PDX）模型的基因表达谱，以空间分辨率解析ER+乳腺癌内部异质性，并阐明雌激素在肿瘤生长中的重要性。 

研究结果

1.ER+乳腺癌PDX模型对E2反应的两面性 

研究者使用雌二醇（Estradiol，E2）处理两种ER+乳腺癌PDX模型（GS3：雌激素抑制型、SC31：雌激素依耐型，在实验过程中表型保持稳定），并设置了对照组。后续用ST技术进行分析并展示两种ER+乳腺癌PDX模型对E2的反应性。

首先通过ST结果排除了小鼠基质细胞对本实验的影响，后续分析了ESR1、PGR、MKI67（分别编码三个重要标记物ER、PR和Ki67）的含量，发现E2处理后GS3 PDX模型中增殖细胞比例（细胞周期的S、G2M期及MKI67基因含量均与细胞增殖相关）减少，而SC31模型中增殖细胞比例增加（图A、B）。GS3 PDX模型中ER表达减少，而SC31 PDX模型ER表达增加，表明ER表达受到雌激素调控；仅在E2处理后的两种PDX模型中发现了PGR的表达，表明PGR的表达依赖于E2（图B）。除此之外，发现E2处理后上调了GS3 PDX模型中ARGE基因（图B，一种多功能的细胞生长因子）。 

研究者根据两种PDX模型的ST数据及EPK细胞分类方法（E：ESR1、P：GR和K：MKI67，P表示阳性/N表示阴性）进行细胞区域划分，发现PNP区域与细胞增殖趋势一致，不同区域在E2处理下显示出不同的细胞生长趋势，这为ER+乳腺癌对雌激素反应具有两面性提供数据支持（图C）。 

2.ER+乳腺癌内部不同的功能区 

研究者通过ST技术鉴定出ER乳腺癌PDX模型中九个不同的细胞群体（ST_0-ST_8），每个群体具有独特的基因表达特征（图A）。分别分布在坏死或瘢痕组织区（ST_3、ST_6、ST_8）和肿瘤区域（ST_0, ST_1, ST_2, ST_4, ST_5、ST_7）。通过对差异表达基因和肿瘤标志基因进行对比并区分出四个独特的功能区：ST_0表达受雌激素调控的基因；ST_2包含许多与增殖相关基因；ST_5：表达与低氧和血管生成相关基因；ST_7：表达与炎症反应相关的基因。 

3.E2对ER+乳腺癌内部不同功能区的影响 

研究者使用E2处理GS3和SC31 PDX模型，并设置对照组，以评估E2对乳腺癌模型中不同功能区的影响。

通过检测ST_0区域中受E2调控的基因（ESTROGEN_RESPONSE_EARLY/LATE）表达情况，发现E2处理后两种模型中这些基因的表达被上调，但增殖特征没有改变，表明ST_0区域的细胞可能不直接参与E2依赖的肿瘤生长。通过检测ST_2区域与细胞增殖相关的基因（E2F_TARGETS、G2M_CHECKPOINT），发现E2处理的GS3 PDX模型中细胞增殖相关基因表达下降，而SC31模型中则升高，表明ST_2区域的细胞与雌激素依赖的肿瘤增殖有关。通过检测ST_5区域中低氧和血管生成相关基因（HYPOXIA、GLYCOLYSIS），发现E2对这些基因的表达水平影响不大。通过检测ST_7区域中炎症相关基因（INTERFERON_ALPHA、GAMMA_RESPONSE），发现E2处理降低了这些基因的表达，特别是在SC31模型中，表明这个区域可能与ER+乳腺癌的治疗抵抗性相关。

综上，E2治疗在大多数ER+乳腺癌的肿瘤细胞中诱导了典型的雌激素调控基因表达，但只有ST_2区域的细胞与肿瘤生长直接相关。 

4.scRNA-seq对ER+乳腺癌内部功能区进一步细分 

研究者通过scRNA-seq数据分析，进一步将ST簇（ST_0, ST_1, ST_2, ST_4, ST_5、ST_7）区分为14个单细胞簇（SC_0-13，图A）。并发现SC_1、SC_3和SC_9显示出高增殖特性，处于细胞分裂S、G2M期周期中（图A~C）。

为了比较在ST数据集和scRNA-seq数据集中识别出的簇，研究者分析了ST和SC簇之间基因特征分数的相关性（图4D），发现ST族与多个SC族相关，表明SC簇以更高分辨率进一步区分ST簇中的细胞。研究者通过对ST_2和SC_1/3/9的ST结果进行映射，发现SC_1/3/9富集的区域对应于ST_2的所在区域（图4E）。 

5.通过EPK分类法对MKI67+细胞进行分类 

研究者对SC单细胞簇中细胞进行EPK细胞分类(图F)，发现MKI67+细胞（PNP、PPP、NPP和NNP）主要分布在增殖性细胞簇（SC_1、SC_3和SC_9）中，表明MKI67+细胞代表了对雌激素依赖性肿瘤生长有贡献的增殖性细胞群。

为评估E2对每组EPK分类细胞的影响，研究者分析了它们在单细胞数据集中受E2处理影响后的比例变化（图4G），PNP细胞的变化与GS3和SC31对E2治疗的反应相关联，而PPP/NPP细胞在E2处理后在SC31模型中的增加比GS3模型显著，表明它们可能在雌激素诱导的增殖反应中发挥作用，这与ST分析结果一致。

6.对GS1 PDX模型进行单细胞测序验证前期数据

为了验证对GS3和SC31分析的结果，研究者对GS1(ER-low,雌激素促进型) PDX模型进行scRNA-seq分析，分为8个簇(0-7簇，图A)。通过分析发现MKI67+细胞（0、2、3、4簇）在S/G2M期的细胞簇中累积（图A~C），与GS3和SC31数据集中观察到的模式相似。

在增殖簇中(MKI67+)，NNP细胞比PNP细胞更为显著(图D)，并且在E2处理后NNP细胞的数量增加（图5E）。研究者确定了与缺氧（簇5）和炎症反应（簇1）相关的基因特征簇，这与前期数据中ST_5、ST_7簇相似（图5F）。 

为了验证雌激素依赖性增殖细胞群的结论，研究者进一步分析了9个ER+乳腺癌患者样本的scRNA-seq数据，分为10个簇（0-9簇，图G），簇9显示出增殖特征，且富含PNP细胞（MKI67+，激素依赖性增殖细胞群）（图5H），这与前期数据相似。 

7.从蛋白质表达水平验证前期数据 

CDK4/6抑制剂可与内分泌疗法联合治疗ER+乳腺癌，其机制是CDK4/6抑制会导致G1期停滞，从而减少处于G2M期的Ki67细胞（Ki67在G2M期细胞中表达最高）。

为评估靶向抑制剂对增殖细胞和肿瘤标志蛋白（ER、PR和Ki67）的影响，研究者使用E2和帕博西尼（Palbociclib，CDK4/6抑制剂）处理SC31 PDX模型进行体内药效实验。免疫组化结果显示E2和帕博西尼联合治疗显著抑制了肿瘤细胞生长（图A）， Ki67+/PR-（EPK细胞分类：PNP、NNP）细胞显著减少，但Ki67+/PR+(EPK细胞分类：NPP、PPP)细胞数量未显著降低，表明帕博西尼不会抑制PR+生长，或者PR表达与非增殖性特征有关（图B）。

8.ER +乳腺癌中4个主要功能分区的临床应用价值 

为了探究四个ST簇的临床意义，研究者使用了来自ST_0、ST_2、ST_5和ST_7区的基因特征，对公共数据集METABRIC进行分析，ST_0在luminalA型患者中分值更高，而ST_2、ST_5和ST_7在luminalB型患者中分值更高（图7A）。ST_2指数高的患者存活时间更短，表明ST_2区室可能与ER+乳腺癌的更侵略性特征相关，ST_0指数高的患者预后更好，表明ST_0可能不直接与雌激素依赖性肿瘤进展相关(图B)。除此之外，研究者发现ST_5在基底样和HER2富集肿瘤中的分数显著更高；乳腺癌各亚型之间的ST_7特征分数差异也显著，但与其他簇相比不明显。

最后，研究者利用之前建立的正常乳腺上皮细胞图谱，结合ER+ PDXs的ST和scRNA-seq数据，增殖性SC簇与正常乳腺干/祖细胞具有相似性(MKI67+细胞仅存在于祖细胞群中)，这些细胞为ER+乳腺癌的增殖提供了主要驱动力，也为ER+乳腺癌治疗了提供靶点。 

结论

本项研究通过ST和scRNA-seq技术对ER+乳腺癌进行了深入分析，揭示了肿瘤内部的异质性，并确定了四个空间上不同的功能区室（雌激素反应性、增殖性、低氧诱导性和炎症相关性），这些区室在ER+乳腺癌的发展中发挥了不同作用。

研究发现与增殖性标记物Ki67表达相关的细胞群体（ST_2）是ER+乳腺癌生长的主要驱动力，并且与较差的临床结果相关;而雌激素反应性细胞群体（ST_0）则与较好的预后相关;低氧诱导（ST_5）和炎症相关（ST_7）区室与ER+乳腺癌的侵袭性和治疗抵抗性有关。

这些发现不仅增进了我们对ER+乳腺癌分子特征的理解，而且为开发新的治疗策略和改善患者预后提供了重要信息。 

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。 

REFERENCE：Yoshitake R, Mori H, Ha D, Wu X, Wang J, Wang X, Saeki K, Chang G, Shim HJ, Chan Y, Chen S. Molecular features of luminal breast cancer defined through spatial and single-cell transcriptomics. Clin Transl Med. 2024 Jan;14(1):e1548. doi: 10.1002/ctm2.1548. PMID: 38282415; PMCID: PMC10823285.