Impact factor: 14.3（2024）

Published online：2024-7-18 

研究背景 

胃癌（Gastric Cancer, GC）是全球癌症死亡的第二大原因。近年来，早期GC患者可以通过手术切除得到有效治疗，但晚期GC患者的五年生存率仍然很低。

细胞外基质（Tumor Microenvironment，ECM）对肿瘤细胞的生物学特性和信号传导具有重要影响，与肿瘤恶性进展的关键因素相关。盘状结构域受体1（Discoidin Domain Receptor 1,DDR1）作为ECM的主要受体之一，是一种跨膜受体酪氨酸激酶，与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程密切相关。然而，DDR1在GC中的作用机制尚不完全清楚。

缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）是一种在细胞对缺氧环境响应中起关键作用的转录因子。在肿瘤中，HIF-1α的异常激活与肿瘤的恶性进展紧密相关。

本文研究了DDR1在GC进展中的作用机制，并通过体内外模型探索了DDR1与HIF-1α相互作用的可能性。研究还涉及了寻找针对DDR1的治疗策略，以期为胃癌患者提供更有效的治疗选择。 

研究结果

1.DDR1表达升高与GC恶性进展相关 

研究者通过分析胃腺癌癌症基因组图谱，发现DDR1是GC中唯一上调的具有激酶活性的胶原结合受体(图a)。通过分析GC临床患者的肿瘤组织及配对癌旁组织的基因组图谱，发现DDR1在GC临床患者的肿瘤组织中高表达(图b)。免疫组化（IHC）结果显示DDR1的表达与肿瘤分级呈正相关(图c)。

研究者对GC细胞进行转录组分析及GO分析，发现血管生产相关基因在DDR1过表达的GC细胞中显著富集(图h )。免疫荧光（IF）结果显示DDR1表达与血管标志物CD31的表达呈正相关（图i）。IHC结果显示DDR1与VEGF-A（血管生成关键调节因子之一）表达呈正相关，说明VEGF-A可能是DDR1促血管生成作用的主要介质之一（图k）。 

2.DDR1通过HIF-1α诱导GC血管生成 

研究者构建了DDR1过表达的HGC27和AGS细胞(两种人胃癌细胞系)并进行基因富集分析，结果显示血管内皮生长因子（VEGFs）信号通路相关基因在DDR1过表达的HGC27细胞中显著上调(图a )。DDR1过表达增加了VEGF-A的mRNA水平(图b )及蛋白表达水平（图c , d），表明DDR1可能通过增加VEGF-A水平促进毛细血管形成。

研究表明，HIF-1α、PDGF和FGF2是VEGF-A的主要调节因子，但在DDR1过表达的胃癌细胞中，只有HIF-1α的表达上调 (图e )。研究者在DDR1过表达的GC细胞中沉默HIF1A（HIF-1α蛋白的表达基因）并用该细胞培养基处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），结果发现HUVECs细胞的迁移和血管形成受到显著抑制(图f，g)；HIF1A敲低也显著降低了VEGF-A的mRNA及蛋白的水平(图h , i)。进一步在DDR1敲除的GC细胞中过表达HIF1A，结果显示过表达HIF1A挽救了因DDR1敲除导致的HUVECs细胞迁移和血管形成的抑制作用。

综上，DDR1诱导的胃癌血管生成是由HIF-1α介导的。 

3.DDR1通过抑制HIF-1α蛋白的泛素化来稳定HIF-1α蛋白 

研究者发现DDR1过表达均增加了HIF-1α的蛋白水平，但HIF1A的mRNA水平保持不变。为了研究DDR1是否通过影响HIF-1α的蛋白稳定性来调节HIF-1α蛋白含量。

研究者用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺( CHX )处理DDR1过表达的GC细胞。结果显示，DDR1过表达显著减弱了胃癌细胞中HIF-1α蛋白的降解(图e )。研究者进一步在DDR1敲除的GC细胞中使用蛋白酶体抑制剂MG132，结果显示MG132逆转了DDR1敲除GC细胞中HIF-1α水平的降低(图f )。

4.DDR1与HIF-1α相互作用，促进胃癌血管生成 

研究人员通过免疫荧光染色（IF）和免疫共沉淀实验(CO-IP)揭示了DDR1与HIF-1α在胃癌细胞中存在相互作用（图a~c）。

并发现HIF-1α的Per / ARNT / Sim ( PAS)结构域是与DDR1结合的关键区域。这一结合对于DDR1诱导的VEGF-A表达上调、HUVECs细胞迁移和管状结构形成至关重要（图i）。表明DDR1通过直接与HIF-1α的PAS结构域相互作用，调控其泛素-蛋白酶体途径的降解，进而促进胃癌血管生成。  

5.DDR1通过RhoA/ROCK1信号通路调控肌动蛋白细胞骨架重组，促进肿瘤转移 

有研究表明，DDR1在不同类型的细胞中对肌动蛋白细胞骨架的重组发挥不同的作用。在GC细胞中，DDR1的过表达促进了细胞伪足的生成，这表明GC细胞系的迁移能力增加（图a）。RhoA是一种重要的肌动蛋白细胞骨架重组调节因子，RhoA的激活(GTP-RhoA)可以诱导血管平滑肌细胞的肌动蛋白细胞骨架重塑。通过WB实验发现，DDR1的过度表达增强了RhoA活性（图b），还激活了RhoA的下游效应器Rho相关蛋白激酶1（ROCK1），进而通过磷酸化LIM激酶（LIMK）和肌球蛋白轻链（MLC）来调节肌动蛋白丝的组织（图c）。

上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）是肿瘤转移的关键过程，HGC27和AGS细胞中DDR1过表达时，上皮标记物E-钙粘蛋白（E-Cadherin）的表达减少，而包括N-钙粘蛋白（N-Cadherin）和肌间蛋白（Vimentin）在内的间充质标记物的表达增加（图d~f），这表明DDR1促进了EMT。研究人员通过IHC分析了临床GC样本，发现DDR1与肌间蛋白表达之间的存在正相关性，与E-钙粘蛋白表达之间的负相关性（图g、h）。

为了探究ROCK信号通路在DDR1诱导EMT中的作用，研究人员使用了ROCK抑制剂Y-27632处理GC细胞，结果发现Y-27632逆转了DDR1诱导的E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白（ZO-1）的下调(图i）。

综上，DDR1可能通过激活RhoA/ROCK1信号通路来调节肌动蛋白细胞骨架的重组，从而促进EMT和肿瘤细胞的转移。 

6.HIF-1α通过介导RhoA/ROCK1信号的激活，促进GC细胞中肌动蛋白细胞骨架的重组 

研究者在DDR1过表达的GC细胞系中沉默HIF1A，结果显示显著抑制了RhoA及其下游效应物的活性，包括磷酸化的LIMK和磷酸化的MLC（图a,b）。此外，荧光素磷酸化酶染色显示，在HIF1A敲低后，肌动蛋白应激纤维和伪足的形成减少（图c,d）。HIF1A的敲低可以减缓DDR1过表达引起的GC细胞EMT（图e–g）；减少了DDR1过表达的GC细胞的转移能力。

7.DDR1在体内通过HIF-1α促进胃癌进展 

为了进一步探索DDR1在体内对GC肿瘤进展的影响，研究者使用DDR1过表达和野生型的AGS细胞建立细胞系异种移植模型（Cell Line Xenograft, CDX）。接种4周后处死荷瘤小鼠，结果发现与对照组相比，DDR1过表达组形成的肿瘤表现出体积显著增加（图a）。IF结果显示CD31表达升高，表明DDR1过表达的肿瘤微血管密度增加（图b,c）。 

为了探索DDR1对癌症转移能力的影响，研究者通过向小鼠尾静脉注射GC细胞建立了肺转移模型。H&E染色显示DDR1过表达增加了肺微转移结节的数量（图e）。为探索HIF-1α对DDR1诱导的体内血管生成和转移中的功能作用，研究者构建了DDR1过表达且HIF1A敲低的AGS细胞CDX模型。与对照组相比，HIF1A敲低显著减弱了裸鼠中DDR1过表达引起的肿瘤体积增加（图f）。HIF1A敲低后，异种移植物中CD31和VEGF-A的水平也降低（图g），表明HIF-1α与DDR1的体内血管生成效应相关。此外，HIF1A沉默还逆转了DDR1过表达引起的EMT（图h）。

8. DDR1抑制剂可有效抑制GC PDX模型及类器官的恶性进展 

研究者使用两个患者来源的GC样本构建了患者来源异种移植模型（Patient-Derived Xenograft, PDX），分别为PDX1和PDX2。当PDX荷瘤小鼠肿瘤约200 mm³时，将荷瘤小鼠随机分组，并给予7rh苯酰胺（一种高选择性的DDR1抑制剂）治疗。结果显示，与对照组相比，7rh苯酰胺治疗有效抑制了荷瘤小鼠肿瘤生长（图a~c）。IHC结果表明，DDR1抑制后，阻断了HIF-1α和VEGF-A的表达，并在PDX模型中上调了E-钙粘蛋白的表达（图d,e）。 

研究者进一步使用原发性胃癌标本建立类器官模型来评估7rh苯酰胺的疗效（图f）。IF染色的结果表明，在类器官模型中DDR1抑制后，细胞骨架重组也受到了抑制，增强了E-钙粘蛋白和ZO-1的表达（图g），表明逆转了EMT。

结论

本研究发现，DDR1通过直接与HIF-1α相互作用，抑制HIF-1α蛋白的泛素化来稳定HIF-1α蛋白，进而激活了其下游靶基因VEGF-A，促进肿瘤血管生成。此外，DDR1还通过HIF-1α/RhoA/ROCK1信号通路诱导肌动蛋白细胞骨架的重组，增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，进而推动了肿瘤的EMT过程和转移。

这些发现不仅阐明了DDR1在胃癌恶性进展中的关键作用，而且为胃癌的靶向治疗提供了新的策略和潜在的治疗候选药物，展现了DDR1作为治疗靶点的转化医学潜力。  

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。

REFERENCE：

Wei Z, Li J, Zhong L, Yang D, Li W, Chen W, Zhou H, He Y, Song W, Wang B, Zeng L. DDR1 Drives Malignant Progression of Gastric Cancer by Suppressing HIF-1α Ubiquitination and Degradation. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 18:e2308395. doi: 10.1002/advs.202308395. Epub ahead of print. PMID: 39024501.