Impact factor: 27.7（2024）

Published online：2024-7-9 

研究背景

头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC）是全球第六大常见癌症，过去十年中HNSCC患者总体生存率并未有显著提高。因此，研究HNSCC发病的分子机制，寻找新的治疗靶点变得尤为重要。

磷酸果糖激酶血小板型（Phosphofructokinase-platelet, PFKP）是糖酵解途径中的一个关键限速酶。PFKP在多种人类癌症的发展中起着至关重要的作用，但其在HNSCC中的具体作用尚不完全清楚。

c-Myc是一个涉及细胞增殖、分化、上皮-间充质转化和肿瘤微环境调节等多种生物过程的转录因子。c-Myc在HNSCC中的过表达与预后不良相关，但其在HNSCC中的机制尚不清楚。

本研究通过多种体内外模型评估PFKP和c-Myc在HNSCC中的表达情况及作用机制。 

研究结果

1.PFKP表达升高与HNSCC患者的不良预后相关

研究者通过分析TCGA-HNSCC数据库发现HNSCC肿瘤组织中PFKP表达升高，与患者的低生存率相关（图A、B）。后续对HNSCC肿瘤组织及其邻近正常组织进行免疫组化染色（IHC）和蛋白免疫印迹实验（WB），结果均显示肿瘤组织中PFKP的表达水平显著升高（图C~F）。此外，与人正常口腔上皮细胞(NOK)相比，人HNSCC细胞（CAL27、LIU-LSC-1、TU212）中PFKP的表达水平更高（图G、H）。

2.PFKP在体外模型中促进HNSCC进展 

研究者通过在LIU-LSC-1细胞（PFKP高表达HNSCC细胞）中降低PFKP表达，在TU177细胞（PFKP低表达HNSCC细胞）中提高PFKP表达，结果发现PFKP敲低导致LIU-LSC-1细胞增殖减少，而过表达PFKP则促进了TU177细胞增殖（A~C）。

研究者通过建立HNSCC患者衍生的类器官(Patient-Derived Organoid，PDO)模型，发现PDO#1（PFKP高表达）在PFKP敲低后生长减缓，而PDO#1（PFKP低表达）在PFKP过表达后生长加速（图G），且Ki-67阳性细胞的比例与PFKP蛋白表达水平的增加成正比（图F、H）。

由于PFKP与肿瘤血管生成有关，研究者进行了体外毛细血管管状结构形成实验，与对照细胞相比，PFKP敲低后生成的类毛细血管结构和分支更少（图I），PFKP过表达则相反（图J）。后续通过细胞迁移和侵袭实验，发现PFKP敲低显著抑制了LIU-LSC-1细胞的迁移和侵袭（图K），PFKP过表达则相反（图L）。

3.PFKP在体内模型中促进HNSCC进展

研究者构建了LIU-LSC-1和TU177细胞的异种移植瘤模型（Cell line-derived xenograft, CDX），分别设置敲低和过表达对照组。结果发现PFKP敲低显著抑制了肿瘤生长（图A~C），PFKP过表达促进肿瘤生长（图D~F）。

IHC结果显示，PFKP敲低显著降低了肿瘤组织中Ki-67（增殖标志物）和CD31（血管生成标志物）的表达（图G、H）；而过表达的结果相反（图G、I）。

研究者通过鸡胚绒毛尿囊膜（Chicken Chorioallantoic Membrane, CAM）实验探究了PFKP在体内对HNSCC肿瘤血管生成的促进作用，结果发现LIU-LSC-1 PFKP敲低组导致肿瘤血管生成减少，TU177  PFKP过表达组促进了肿瘤血管形成（图J、K）。

通过尾静脉注射肺转移模型研究了PFKP对HNSCC肿瘤转移的影响，结果发现LIU-LSC-1  PFKP敲低组导致肿瘤转移结节数量显著减少，小鼠湿肺重量显著下降（图L-N）；TU177  PFKP过表达组结果相反（图Q~S）

4.PFKP与ERK2相互作用，激活MAPK/ERK通路

MAPK/ERK（丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶）信号通路在多种癌症类型中普遍存在，超过90% HNSCC患者中可检测到磷酸化的ERK1/2（p-ERK1/2）。研究者通过对LIU-LSC-1细胞（PFKP敲低组和对照组）的RNA测序结果进行分析，发现PFKP敲低后MAPK途径相关基因的表达发生显著变化。通过WB实验发现PFKP敲低后导致p-ERK1/2水平下降，PFKP过表达后导致p-ERK1/2水平升高（图C）；通过免疫沉淀（IP）、免疫荧光（IF）及共免疫沉淀（CoIP）发现PFKP和ERK2在LIU-LSC-1细胞中存在内源性相互作用（图D~G）。

5.PFKP通过激活ERK通路增强c-Myc蛋白的稳定性 

已有报道表明在c-Myc（一种细胞转录因子）的S62位点进行磷酸化（p-S62-Myc）可调节c-Myc蛋白的稳定性。通过WB及IF实验发现，PFKP敲低导致LIU-LSC-1细胞中c-Myc和p-S62-Myc水平降低，PFKP过表达导致TU177细胞中c-Myc和p-S62-Myc水平上调（图B、C，这与p-ERK1/2表达水平一致）。通过qRT-PCR分析进一步揭示了PFKP对c-Myc的调节不是在mRNA转录水平（图D、E）；当TU177细胞中ERK2被敲低时，PFKP的过表达并没有增加c-Myc水平（图F）。因此，PFKP需通过ERK通路影响c-Myc蛋白的表达水平。

研究者通过对PFKP敲低的LIU-LSC-1细胞和PFKP过表达的TU177细胞进行环己酰亚胺（Cycloheximide，CHX）追踪分析（用于确定蛋白质半衰期的实验方法）和泛素化分析，发现PFKP敲低的LIU-LSC-1细胞中c-Myc降解速度显著增加（图G、H）；使用MG132（一种特异性26S蛋白酶体抑制剂）进行预处理，可抑制因PFKP敲低引起的c-Myc降解（图I）。

6.c-Myc参与PFKP介导的HNSCC进展

研究者在PFKP敲低的LIU-LSC-1细胞中过表达了c-Myc，发现c-Myc过表达逆转了PFKP敲低对LIU-LSC-1细胞增殖的影响（图A~C）。此外，c-Myc过表达逆转了PFKP敲低对类血管生成、迁移和侵袭的抑制效果（图D、E）。

研究者进一步在PFKP敲低的LIU-LSC-1 CDX模型中过表达c-Myc，发现c-Myc的过表达抵消了PFKP敲低对肿瘤生长的抑制作用（图F~H），这与体外结果一致。

7.c-Myc促进PFKP的转录

研究者通过多个数据库分析，发现高c-Myc mRNA水平的HNSCC患者与预后不良相关。通过在LIU-LSC-1细胞中敲低c-Myc，发现PFKP表达的显著降低（图E）；相反，c-Myc的过表达导致PFKP在蛋白和mRNA水平上的表达增加（图F）。

通过分析PFKP的启动子区域及ChIP-PCR检测，发现在c-Myc过表达的细胞中，c-Myc在PFKP启动子区域富集（图K）。因此，c-Myc可能通过直接结合到PFKP基因的启动子来上调PFKP基因的转录。

8.靶向PFKP和c-Myc可抑制HNSCC肿瘤进展

研究者使用HNSCC PDO模型评估了PFKP抑制剂（PFKP siRNA）与c-Myc抑制剂（10,058-F4）联合治疗的疗效。结果显示，PFKP和c-Myc的联合抑制比单抑制剂治疗更有效地抑制HNSCC PDO的生长。

研究者进一步使用高表达PFKP和c-Myc的新鲜HNSCC肿瘤组织（HPV阴性）建立患者源性异种移植（Patient-Derived Xenograft，PDX）模型。结果显示，PFKP和c-Myc的联合抑制比单抑制剂治疗更有效地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长（图E-G），治疗组小鼠体重无明显变化（图H）。

结论

本研究发现PFKP能够通过ERK途径增强c-Myc蛋白稳定性，而c-Myc又能够促进PFKP的转录，这一相互作用环路促进了HNSCC细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成，导致患者的不良预后相关。本研究还发现通过同时靶向PFKP和c-Myc可能是治疗HNSCC的有效策略。 

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。 

REFERENCE：

Liu W, Ding Z, Tao Y, Liu S, Jiang M, Yi F, Wang Z, Han Y, Zong H, Li D, Zhu Y, Xie Z, Sang S, Chen X, Miao M, Chen X, Lin W, Zhao Y, Zheng G, Zafereo M, Li G, Wu J, Zha X, Liu Y. A positive feedback loop between PFKP and c-Myc drives head and neck squamous cell carcinoma progression. Mol Cancer. 2024 Jul 9;23(1):141. doi: 10.1186/s12943-024-02051-6. PMID: 38982480; PMCID: PMC11232239.