目的：探讨尼莫地平对小鼠肝部分切除术后认知功能损伤的保护作用及作用机制

方法：将36只18-20月龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为三组:对照组(C组，n=12)，不做任何特殊处理;手术组(S组，n=12)，小鼠在麻醉后进行肝部分切除术;尼莫地平组(Nimo组，n= 12)，手术与S组相同，并于术前1d开始腹腔注射尼莫地平.每组于术后3d处死实验小鼠，迅速获取海马组织。'I'迷宫实验检测实验小鼠术后3d的学习和记忆能力;Nissel染色及透射电镜观察实验小鼠海马神经元存活的数量及超微结构改变;免疫组织化学方法检测实验小鼠海马Fas和FasL的蛋自表达。

结果与C组比较，S组小鼠认知功能术后3d明显下降(p < 0.05 );与S组比较，Nimo组可改善小鼠术后3c!的认知功能(P < 0.05 ) 。Nissel染色可见Nimo组术后3d小鼠海马神经元存活数量较S组明显增多;透射电镜下可见Nimo组术后3d小鼠海马组织的超微结构改变较S组明显减轻。Nimo组术后3d小鼠海马组织Fas和FasL表达较S组减少(P < 0.01)。结论尼莫地平可通过抑制Fas/FasL介导的海马神经元凋亡而改善老龄小鼠的术后认知功能。

【关键词】尼莫地平;肝部分切除术;认知功能; Fas和FasL

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dvs-function, POCD )是老年人的常见术后并发症之一，主要表现为认知功能受损，包括学习能力和记忆能力的下降、意识和信息处理的障碍等中枢神经系统功能障碍，严重者可以出现痴呆。研究显示，25-50%的住院患者在术后会发生认知功能的改变，同时大约40%的患者在术后5年仍会有认知受损的表现。日前认为老龄是唯一明确的POCD的危险因素，手术创伤可能是主要的原因。通过研究发现老龄鼠脑内存在脑神经元大量凋亡的现象，而这种神经细胞数量的减少可能是引起脑老化性认知功能障碍的重要原因。同时研究已经证实细胞凋亡是包括阿尔茨海默病(AD)在内的多种神经退行性疾病的一个共同的病理特征。但细胞凋亡机制是否与POCD相关还有待于进一步研究。本研究模拟临床手术过程，通过对老年小鼠行肝部分切除术，观察手术创伤所致老龄小鼠认知功能的下降与海马神经元凋亡的关系及尼莫地平的保护作用。 

1材料与方法

1.1实验动物与分组

    选择健康的1820月龄C57BL雌性老龄小鼠，许可证号XC-XK(京)2012-0001，购自北京维通利华公司。实验过程符合《中华人民共和国实验动物管理条例》及伦理要求。将小鼠随机分为3组:对照组(C组)、手术组(S组)和尼莫地平组(Nimo组)，每组各12只。C组小鼠不做任何特殊处理，S组小鼠在麻醉后行肝部分切除术，Nimo组小鼠手术与S组相同，于术前1d开始腹腔注射尼莫地平，每日1次。T迷宫系统，购自上海欣软信息科技有限公司。

1.2手术模型建立

肝部分切除术具体步骤:10%水合氯醛麻醉后，手术切口处备皮，消毒，上腹部正中做一小切口，游离切除左侧部分肝脏，用75%酒精棉球压迫止血，伤口用0.25%布比卡因浸润止痛，用缝线缝合伤口，并予以抗生素敷于伤口，所有手术步骤均为无菌操作。后将老鼠移至温箱苏醒，苏醒后放回笼子中各自饲养。

1.3实验动物的认知功能检测

T迷宫检测是在T字型的迷宫中寻找食物以检测动物对食物的空间工作记忆情况。术后3 d行T迷宫检测，实验过程中，小鼠控制饮食，但可自由饮水。每只小鼠均予训练5个实验，每个实验包括一个预备实验与一个正式实验。预备实验将其中的一个臂关闭，允许小鼠进人来获取食物，取食结束后，小鼠放回起始区，停留大约l0s之后，进行正式实验测试.正式实验时将起始臂和目标臂同时打开。若小鼠的选择是未曾进入的臂，则为正确选择，可获得食物奖励。若小鼠重复进入了相同的臂，为错误选择，将不子以奖励。实验间隔为10 min。延长预备实验和正式实验间的时间间隔至90,180 s来测试，检测术后3d小鼠的空间工作记忆能力。 

1.4形态学观察

术后第3天心脏灌注固定后处死动物，各组动物摘取双侧海马，使用4%多聚甲醛及2.5%戊二醛固定，常规方法来制备石蜡及电镜切片，进行Nissel染色，分别进行光镜与电镜的观察。

1.5免疫组化染色

    对各组海马组织凋亡相关蛋自Fas,、FasL进行染色。Fas、FasL一抗为兔抗小鼠IgG，二抗为生物素标记的山羊抗兔IgG。染色法按免疫组化试剂盒说明进行操作。以胞浆出现棕黄色染色为阳性，染色阴性对照以PBS代替一抗。

1.6统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据的分析处理，计量资料以均数标准差表示，两组间的比较采用Student t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1尼莫地平对术后小鼠认知功能的影响(T迷宫)

通过检测10,90,180s的延缓间隔，结果发现术后3dS组小鼠的正确率与C组比较明显降低(P<0.05 );而Nimo组小鼠的正确率与S组小鼠比较明显改善(P < 0.05 )。 

2.2尼莫地平对手术小鼠形态学的影响

    Nissel染色结果可见术后3d海马区存活的神经元细胞数量减少，神经胞质颜色变浅，尼氏小体模糊、消散。Nimo组小鼠海马区存活的神经元数量增多。电镜下发现术后3d的S组小鼠海马神经元及胶质细胞有核固缩、核内染色质边集、线粒体肿胀以及电子密度减低等改变，经过尼莫地平治疗后，可见神经元及胶质细胞的形态相对完整，而且线粒体肿胀减轻。见图 2 , 3(封四)。

2.3尼莫地平对手术小鼠海马凋亡蛋白Fas/FasL表达的影响

与C组比较，术后3d S组小鼠海马Fas/FasL表达增加 (P<0.01)，而与S组比较，Nimo组小鼠海马Fas/FasL表达明显降低(p<0.01) 

3讨论

目前POCD的发病机制存在多种学说，研究发现，老年性痴呆A(3学说和Tau蛋白磷酸化学说参与了POCD的发病[91，推测P}CD与AD可能存在相同的发病机制。细胞凋亡是AD的发病机制之一，然而，细胞凋亡与POCD的关系尚未见报道。

细胞凋亡是体内维持自身生理状态相对稳定的重要调节机制之一，发生异常增加或减少均可导致组织器官的结构或功能改变目前研究认为细胞凋亡主要有死亡受体途径(外源性途径)、线粒体途径与内质网应激途径(内源性途径)}’川本研究主要讨论死亡受体途径，Fas系统是一类与凋亡有关的基因，是位于细胞膜上的一个受体，属于I型膜蛋自，由胞外区、穿膜区、胞浆区组成，具有含2}5个半眺氨酸的细胞外重复序列与细胞内死亡区域(DD),DD是转导细胞凋亡信号所不可或缺的，其对应物的死亡配体为Fast。受体与配体特异性结合可经死亡域传导死亡信号从而介导细胞凋亡。

本实验主要探讨了手术创伤对老龄小鼠海马区凋亡蛋白Fas/Fast的表达影响以及经尼莫地平治疗后对术后认知功能的改善作用与机制，结果表明手术创伤可导致实验鼠海马区凋亡蛋自Fas/F'asL表达的增力[Cl，而在给予尼莫地平治疗后S组小鼠的认知功能明显改善，海马神经元损伤减轻，伴有海马区Fas/F'asL表达的减少，因此，本实验发现细胞凋亡可能参与了POCD的发病，而尼莫地平可能通过抑制细胞凋一亡发挥对POCD的神经保护作用。

尼莫地平为1,4二氢毗陡衍生物，是继维拉帕米、硝苯地平之后的第二代钙通道阻滞剂，也广泛用于治疗脑血管病及认知障碍胜疾病等。其半衰期为2 h,注射1 m姚g后脑内浓度在巧min达高峰。电生理研究发现，尼莫地平可选择性地与L型CaZ'通道结合，有较高的脂溶性，极易通过血脑屏障，在脑中较其他钙离子通道阻滞剂有更大的容积分布及较强的受体亲和力。尼莫地平可降低细胞内钙超载，减少氧自由基产生，改善缺血区脑循环，抑制细胞凋亡。

本研究结果为POCD发病机制的研究及新的靶向治疗奠定了理论基础。