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实验方法

病理标本的取材、固定、切片

2019年02月12日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见人类疾病动物模型的制备方法》 作者:秦川 责任编辑:yjcadmin

1常用器械及使用方法

常用的器械有解剖刀、外科手术剪、脑刀、骨剪、镊子、骨锯、探针、拉钩、载玻片、放大镜、注射器等。

1.解剖刀  主要用于切开和分割软组织,刀片宜用血管钳(持针钳也可)夹持安装,避免割伤手指。常用的持刀法有以下4种:执弓式、抓持式、执笔式、反挑式。

2.手术剪  用于分离与剪开。

3.血管钳  用于分离和钳夹组织,钳夹缝合针和布巾等。

4.手术镊  用于夹持组织,以利于解剖和缝合。

5.拉钩  用于牵引和暴露。

2病理取材的基本要求

从大体标本上按照病理检查的目的和要求切取适当大小的组织块,供制片进行显微镜检查。为达到诊断的目的,取得合适的组织是关键。这不仅要求材料要尽可能新鲜,而且要有一定的数量和良好的质量。

1.活检组织标本在手术切下后应立即放入10%福尔马林固定(电子显微镜标本则用适当的固定液固定)。尸检标本应争取在死亡后尽可能短的时间内取材。

2.通常选择正常与病变交界处组织,即包括病变本身及病变周围组织。

3.对照组动物相同器官取材时,选材部位应尽量一致。

4.肉眼看不到明显的病变时,各试验组选取标本位置应一致。

5.所选组织应包括脏器全部层次结构或重要结构,如肾应包括皮质、髓质和肾盂。

6.体积大和分叶的器官,应视不同组织选取多个部位,小器官可整体取材并固定,如淋巴结、扁桃体、甲状腺等。

7.胃肠标本应将内容物冲洗掉,以免内容物影响组织固定,产生自溶。

8.所取材料应尽量保持肉眼标本的完整性,不宜过厚或过薄,一般厚约3~5mm,大小为1.5~2cm2。

9.切取组织时不要挤压,应使用锋利刀具,少用剪刀,勿选用被器械钳压过的部位。

10.标本取材要熟练,尽可能快地完成整个过程,特别是易自溶的组织,如肠道、脑、腺体等。

11.第一次取材组织不能作出确诊时,须再次甚至多次取材。每次取材均应将送检单加以记录。

12.组织取材完毕,标本应按序存放,并加足固定液以备复查之用。通常保留1个月后,再清理销毁。

3病理取材的基本操作

1.切开  在同一平面上时,先绷紧组织,将刀刃与平面垂直,用力要得当,一次垂直切开,切口整齐而不偏斜,禁止斜切和锯切,以减少损伤。切开多层组织时,一般应按组织层次分层切开,避免损伤深层组织器官。

2.组织分离法  可用锐性分离法,使用刀、剪等锐性器械直接切割,如皮肤、黏膜、精细结构和紧密连接组织的分离;也可用钝性分离法,使用分柄、止血钳、剥离器、手指等分离,如肌肉、疏松结缔组织等的分离。

3.结扎  用丝线打结的方法结扎组织和血管,用于缝合器官和皮肤。

4.止血  大量出血导致胸、腹部积血使剖检视野模糊不清,可能会影响和干扰病变的辨别和取材,因此动物剖检有时要进行止血,常用方法有纱布块压迫止血法、钳夹止血法、结扎止血法。

4取材程序

剖检顺序多为先腹腔后胸腔,再脑、脊髓、骨髓、皮肤肌肉等。取材顺序基本与此相同。

1.腹腔和腹腔器官  沿腹部正中线切开剑突至肛门之间的腹前壁,再沿最低位肋骨分别向左右两侧切开侧腹壁至脊柱两旁,完全暴露腹腔器官。观察有无积液、血液和炎性渗出物,如有则用吸管吸出,测量容积并经离心沉淀涂片检查,必要时作细菌培养。检查黏膜是否光滑,有无充血、淤血、出血、破裂、脓肿、粘连、肿瘤、寄生虫等,检查膈的紧张度及有无破裂。

(1)脾:检查大小、厚薄、硬度、性状、色泽,是否肥厚、破裂等。然后沿长轴将脾切成两半,切面要平整,检查脾小梁、红髓、滤泡的色泽、切面的出血量。

(2)胰腺:检查胰腺色泽和硬度,切面检查有无出血。

(3)胃肠:检查胃的大小、胃肠道浆膜面的色泽,有无粘连、肿瘤、寄生虫结节。然后沿胃大弯、肠系膜附着部依次剪开胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠。观察胃内有无异物,内容物的气味及性状,除去内容物,检查黏膜颜色,有无充血、出血、化脓。采用边剪开边观察的办法检查肠管,观察肠内容物数量、性状,有无气体、血液、异物、寄生虫,肠黏膜皱襞有无增厚、水肿、充血、黏液量、溃疡、坏死、淋巴组织性状及有无炎症。

(4)肾:首先检查肾的大小、硬度,被膜是否容易剥离,肾表面的色泽、平滑度,有无瘢痕、出血变化。然后检查切面皮质和髓质的色泽,有无淤血、出血、化脓和梗死。注意观察皮质和髓质交界处的切面是否隆凸,以及肾盂、输尿管、肾淋巴结的性状,有无肿瘤及寄生虫等。

(5)肝:首先检查肝的大小、被膜的性状、边缘的厚薄、实质的硬度和色泽,以及肝淋巴结、血管、肝管等的性状。然后作切面,检查切面的出血量、色泽,肝小叶性状、有无脓肿、肝坏死等变化。

(6)肾上腺:观察外形、大小、色泽和硬度,作纵切和横切,检查皮质和髓质的色泽及有无出血。

2.盆腔器官

(1)膀胱:检查膀胱的大小、尿量及色泽,黏膜有无出血、炎症和结石等。

(2)雄性生殖器官:检查睾丸、附睾、凝固腺、前列腺有无粘连、出血、水肿、积液等。

(3)雌性生殖器官:沿子宫体背侧剪开子宫角,检查子宫内膜的色泽、有无充血、出血、炎症等,观察卵巢和输卵管有无粘连、出血、水肿、积液等。

3.胸腔、口腔及其器官用镊子夹住胸骨剑突,剪断膈肌与胸骨的连接,提起胸骨,在胸椎两侧分别剪断左、右侧胸壁的肋骨,取下整个胸壁,打开胸腔,依次取出胸腺和心脏。将下颌骨的两下颌支内侧与舌连接的肌肉切断,将咽、喉、气管、食管与周围组织分离,用镊子夹住气管向上提起,剪断肺与胸膜的连接韧带,然后将咽、喉、气管、食管连同整个肺一并取出。如有积液应观察其数量和性状,尽量吸取,测量容积并涂片,检查胸膜色泽,有无出血、充血或粘连。

(1)心脏:剪开心包膜,暴露心脏,注意心包的光泽度及心包内液体的情况,心脏的大小、外形、心外膜情况。自下腔静脉入口处至右心房作直线剖开,从此直线中点沿心脏右缘剖至心尖部,从距离心尖部与心室间隔右侧1cm处平行地剖至肺动脉;检查右心房、右心室、三尖瓣、肺动脉瓣、腱索有否病变。自左、右静脉入口处将左心房直线切开,沿心脏左缘剖至心尖部,再从距离心尖部与心室间隔左侧1cm处平行地剖开左心室的前壁和主动脉,检查二尖瓣、主动脉瓣、腱索有无病变,左心房、左心室内壁有无出血和感染。自冠状动脉口起剪开前降支和旋支,在主动脉根部右侧,于右心室的心外膜找到右冠状动脉主干,先横切一刀,再剪至后降支;观察有无粥样硬化和血栓等。

(2)口腔:检查牙齿的变化,口腔黏膜的色泽,有无外伤、溃疡和白斑,舌黏膜有无出血、外伤及舌苔的情况。

(3)咽喉:观察喉头、会厌软骨黏膜的色泽、淋巴结的性状及喉囊有无积脓。

(4)鼻腔:检查鼻腔和鼻中隔黏膜的色泽,有无出血、炎性水肿、结节、糜烂、溃疡穿孔及瘢痕等。

(5)下颌及颈部淋巴结:检查下颌及颈部淋巴结的大小、硬度、有无出血和化脓等。

(6)气管:检查气管有无出血、黏液量等。

(7)肺:检查肺的色泽,有无出血、炎症、肺气肿、肺萎缩、肿瘤等。

(8)其他器官:检查胸腺、甲状腺、扁桃体等的色泽,有无粘连、一出血、水肿等。

4.颅腔及脑  以猴为例,剥离颅顶部软组织,沿眉弓至枕外隆凸上0.5cm处的连线,用弓形锯环绕该线锯开颅骨外板及板障,然后用丁字凿轻轻凿开内板,揭开颅盖,此时可见覆盖于脑表面的硬脑膜,切开硬脑膜暴露脑组织,在距颅骨锯口断端上0.5cm处,从前向后环行剪开硬脑膜,枕部的硬脑膜应保留1.5cm长,防止取脑过程向后推压脑组织时,枕骨断端损坏枕叶脑组织。向后方轻轻揭起硬脑膜及大脑镰,暴露脑组织,用手指从额骨前上方伸入颅前窝,轻轻推压大脑额叶,直至见到筛板上的嗅球为止,切断嗅丝与嗅球的联系,将嗅球与脑一齐拉起,见到视神经和视交叉时立刻停止,在脑底附近依次切断颈内动脉、视神经,再将脑向后拉,可见到垂体及漏斗,继续将脑向后拉起,切断连于脑的脑神经。从脑干腹侧面把手术刀伸入枕骨大孔,切断脊髓,即可将脑取出,用流水冲洗干净备用。新鲜脑很软,易变形和受挫伤,操作过程中必须用手扶托,取出脑后应立刻用纱布包裹,浸泡固定液中保存,以免变形。

检查软脑膜、硬脑膜血管充盈情况,脑回之间的脑沟中液体的数量与色泽,脑表面凸起或凹下的地方是否明显,可用手触摸判定其硬度。用刀将脑做一水平切面,保留胼胝体,暴露侧脑室,注意检查尾状核有无出血、软化灶,侧脑室内容物数量、性质,然后将脑做多处切面,检查有无变化。

5不同组织的取材方法

对犬进行尸检取材时,各器官组织的取材部位和组织块数大致如下:

1.心和大血管:左、右心室,室间隔各1块,包括由外膜到内膜各层肌组织。左、右心耳各一块。主动脉1块。

2.气管、肺:气管1块。肺3~5块,取自不同的叶。

3.肝、胆囊:肝2~3块,切成正方形和长方形。胆囊1块。

4.脾:1~2块。

5.胰:1块。

6.肾:右肾1块,切成正方形,左肾1块,切成长方形,都包括皮质、髓质和肾盂。

7.膀胱:1块。

8.肾上腺:左、右各取1块。

9.消化道:食管、胃、十二指肠、小肠、大肠各取1块。

10.骨:胸骨1块。

11.胸腺、甲状腺、甲状旁腺、唾液腺:各1块。

12.子宫:宫颈1块,宫体1~2块。

13.睾丸、附睾或卵巢:1块。

14.大脑、小脑、脑干:各1块。

15.垂体:1块,前叶或包括前、后叶。

16.视神经:1块。

17.颈髓、胸髓、腰髓、坐骨神经:各1块。

18.乳腺或前列腺:1块。

19.注射部位皮肤:1块。

20.颈部淋巴结:2~3个。

注意如某些脏器有严重病变,或有特殊情况,应增加取材组织块数,以便彻底检查明确诊断。

对小鼠、大鼠进行尸检取材时,各器官组织的取材部位和组织块数大致如下:

1.心和大血管:心脏1块,其中包括左、右心室,左、右心耳,室间隔。主动脉1块。

2.气管、肺:气管1块。肺3~5块,取自不同的叶。

3.肝、胆囊:肝2块,切成正方形和长方形。胆囊1块。

4.脾:1~2块,取最宽处。

5.胰:1块。

6.肾:右肾1块,切成正方形,左肾1块,切成长方形,都包括皮质、髓质和肾盂。

7.膀胱:1块。

8.肾上腺:左、右各取1块。

9.消化道:食管、胃、空肠、回肠、结肠有淋巴结处和直肠各取1块。

10.骨:胸骨1块。

11.胸腺、甲状腺、甲状旁腺、唾液腺:各1块。

12.子宫:宫颈1块,宫体1~2块。

13.睾丸、附睾或卵巢:1块。

14.大脑、小脑、脑干:各1块。

15.垂体:1块,前叶或包括前、后叶。

16.视神经:1块。

17.颈髓、胸髓、腰髓、坐骨神经:各1块。

18.乳腺或前列腺:1块。

19.注射部位皮肤:1块。

20.颈部淋巴结和肠系膜淋巴结:2~3个。

6活检组织取材

除以上各点外(见前述),还应注意取材后立即用液氮速冻,而且制作冰冻切片的同一块组织一份标本要做常规石蜡切片,用于 HE染色和特殊染色等,有的还要进行免疫组织化学染色甚至电子显微镜观察,因此其组织取材要迅速完成。尽量保持组织结构完整。

细胞标本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活细胞标本的制备等。

1.印片法常用于活检和手术标本,新鲜标本沿病灶中心剖开,将病灶区轻压于载片上,吹干后立即将其浸入固定液内5~10min,取出自然干燥,低温储存。

2.穿刺法常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等,穿刺液少,可直接涂在载片上,细胞尽量涂均匀。穿刺液多,细胞丰富,可滴入装有1~2ml Hanks液试管内,轻轻搅拌,以500转/分低速离心5~10min,弃上清,将沉淀制成细胞悬液(2×100000/ml)。吸一滴涂于载片上,镜检以细胞较密不重叠为好。干燥后即可固定。

3.沉淀法主要用于胸水、腹水、尿液和脑脊液等体液多而细胞少的标本。常规细胞标本制备:细胞多时,可直接吸取少量液体直接涂片,细胞少时,可吸取底部自然沉淀液5ml,以1500转/分离心10min,再涂片。

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