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实验方法

常见染色方法

2019年02月28日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见人类疾病动物模型的制备方法》 作者:秦川 责任编辑:yjcadmin

一、苏木精-伊红染色方法的基本原理

苏木精(haematoxylin)和伊红(eosin)染色方法,简称HE染色方法,是生物学和医学中细胞与组织学最广泛应用的染色方法。HE染色的基本原理:细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸(DNA),带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料结合呈蓝色。细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物,在酸性条件下,其带正电荷的氨基可与带负电荷的酸性染料伊红结合呈不同程度的红色或粉红色。

二、苏木精-伊红染色方法的具体步骤

随着科学技术快速发展和电子计算机的广泛应用,染色自动仪器的出现,许多实验室已用全自动染色机代替人工染色。

1.人工操作HE染色方法

(1)二甲苯Ⅰ脱蜡10min。

(2)二甲苯Ⅱ脱蜡5min。

(3)无水乙醇洗去二甲苯1min×2次。

(4)95%乙醇1min。

(5)90%乙醇1min。

(6)85%乙醇1min。

(7)自来水洗2min。

(8)苏木精染色1~5min。

(9)自来水洗1min。

(10)1%盐酸乙醇分化20s。

(11)自来水洗1min。

(12)稀氨水(1%)反蓝30s。自来水洗或蒸馏水洗1min。

(13)伊红染色20s~5min。

(14)自来水洗30s。

(15)85%乙醇脱水20s。

(16)90%乙醇30s。

(17)95%乙醇Ⅰ1min。

(18)95%乙醇Ⅱ1min。

(19)无水乙醇Ⅰ2min。

(20)无水乙醇Ⅱ2min。

(21)二甲苯Ⅰ2min。

(22)二甲苯Ⅱ2min。

(23)二甲苯Ⅲ2min。

(24)中性树胶或加拿大树胶封片。

2.染色结果

细胞核呈蓝色,细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。

3.冰冻切片HE染色

(1)恒冷箱冰冻切片,粘贴在载玻片上,用95%乙醇95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自来水洗。

(2)苏木精染色1~2min。

(3)自来水洗30s。

(4)1%盐酸乙醇分化20s。

(5)自来水洗20s。

(6)稀氨水30s。

(7)自来水洗20s。

(8)伊红染色20s~1min。

(9)自来水洗10s。

(10)85%乙醇20s。

(11)90%乙醇30s。

(12)95%乙醇1min。

(13)无水乙醇Ⅰ1min。

(14)无水乙醇Ⅱ2min。

(15)二甲苯Ⅰ1min。

(16)二甲苯Ⅱ2min。

(17)二甲苯Ⅲ2min。

(18)中性树胶或加拿大树胶封片。

三、染色液的配制

1.苏木精的配制

苏木精的配方很多,可根据不同需要选用,Harris配方最常用。

(1)Harris苏木精的配制

苏木精1g

硫酸铝钾15g

无水乙醇10ml

蒸馏水200ml

先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾,用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中,煮1min后稍冷却,慢慢加入红色氧化汞0.5g,继续加热至染液变为紫红色,用纱布盖瓶口,用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

(2)Mayer苏木精改良配法

A液

苏木精2g

无水乙醇40ml

B液

硫酸铝钾100g

蒸馏水600ml

稍加热使硫酸铝钾在水中溶解,将苏木精溶于乙醇中,再将A与B液混合煮沸2min。用蒸馏水补足600ml,加入400mg碘酸钠充分混匀,苏木精染液呈紫红色。

(3)Gill改良苏木精染液的配制

苏木精2g

无水乙醇250ml

硫酸铝钾17g

蒸馏水750ml

碘酸钠0.2g

冰醋酸20ml

先将苏木精溶于无水乙醇,再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中。两液溶解后将其混合,加入碘酸钠,待苏木精氧化成紫红色,再加入冰醋酸。

2.伊红溶液的配制

(1)水溶性伊红

伊红Y 0.5~1g

蒸馏水100ml

先将水溶性伊红加入蒸馏水中,用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤,每100ml加冰醋酸1滴。

(2)乙醇性伊红液的配制

伊红Y 0.5~1g

90%乙醇100ml

先将伊红溶于乙醇中,用玻璃棒研碎溶解后,每100ml加冰醋酸1滴。用乙醇性伊红液染细胞浆后可不经水洗直接用85%乙醇脱水。

3.盐酸乙醇分化液的配制

浓盐酸0.5~1ml

75%乙醇99ml

此液用一段时间后需要延长分化时间或更换液体,新液分化时间要短。

4.染色中注意事项

(1)脱蜡:石蜡切片必须经过脱蜡后才能染色,脱蜡前切片要经烘烤,这样使组织与玻璃片粘贴牢固。组织切片脱蜡应彻底,脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间,所有的时间都是指新的二甲苯在室温25℃以下时,如果二甲苯是用过一段时间,切片又比较厚,室温低,应增加脱蜡时间,脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一。

(2)染色:石蜡切片经水洗后放入Harris苏木精染色,一般情况下在新配的苏木精溶液中只需要染1min左右,应根据染片的多少,逐步把染色时间延长。苏木精染色后,不宜在水中和盐酸乙醇停留过长,切片分化程度应在镜下观察,分化过度,应水洗后重新在苏木精中染色,再水洗分化和使切片在自来水或稀氨水中充分变蓝。

新配的伊红染色快,切片染色时间不宜过长,应根据染切片的多少逐步延长染色时间,切片经伊红染色后,水洗时间要短。

(3)脱水:切片经过染色后,通过各级乙醇脱水,首先从低浓度到高浓度,低浓度乙醇对伊红有分化作用,切片经过低浓度时间要短,向高浓度时逐步延长脱水时间,脱水不彻底,使切片发雾,在显微镜下组织结构模糊不清。

(4)透明与封片:石蜡组织切片染色经过脱水后必须经二甲苯处理,使切片透明,才能用树胶封片。常用切片封片胶有国产的中性树胶、光学树胶、加拿大树胶和合成树脂(DPx)。在封片时,树胶不能太稀或太稠,不能滴加得太多或太少,太稀或太少切片容易出现空泡,树胶也不可太多,不要使树胶溢出玻片四周太多。标签要附贴牢固。封片过程中不能对着切片呼气。

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