前言(Introduction)

这次实验的内容是离体大鼠心脏灌流。

离体和在体实验的区别:

我们知道，实验动物的器官在在体的情况下要受到体内多种因素的影响，象神经、体液等因素。那么在离体的情况下呢，由于排除了体内这些因素的影响，就可以相对独立地观察某一个因素(比如某一种药物)对器官的直接作用，使实验条件更为统一，实验结果的分析更为可靠。

对离体实验有哪些要求呢？是不是器官取出来就能做实验呢？必须要模拟在体的环境，比如合适的温度、湿度、营养物质、离子浓度、酸碱度等，因此对实验条件有较为严格的要求。

离体实验也有局限性，由于离体实验脱离了机体正常的生理环境，所以得出的结论也有局限性，不能直接用于在体的情况。举例说明：心脏实施正常的泵血功能需要许多条件，如充分的冠脉血液供应、正常的神经体液调节、合适的心脏前后负荷以及血液酸碱和电解质的平衡等等，这些条件的改变将影响心脏的舒缩功能使心输出量降低。

离体大鼠心脏灌流的特点：

(1) 逆行灌流:正常的血液运行是：血液→肺循环→左心房→左心室→主动脉→舒张期进入冠状动脉→心小、中、大静脉→冠状窦。画图表示：正常的主动脉血流方向是，而本离体心脏灌流的主动脉灌流液的方向是，与正常情况下相反，所以叫做逆行灌流。

(2) 等容收缩：在离体大鼠心脏灌流实验中，把一个弹性很好的球囊经过左心耳插入左心室，左室前负荷的大小就由球囊里生理盐水的多少决定。在观察温度、药物或离子对心脏影响的时候，我们维持前负荷的大小不变，所以等容收缩也是特点之一。

实验目的(Objective)：

1.学会制备离体大鼠心脏灌流的模型。

2.观察前负荷、温度、药物、离子对心脏的影响。

3.模拟离体心肌缺血/再灌注损伤模型，并观察心功能的改变。

实验步骤(Methods)

1.捉拿、称重。

2.麻醉：腹腔注射200g/L乌拉坦0.5ml/100g，要注意麻醉剂量不能过量，过量后会影响心功能，甚至造成大鼠的死亡(宁少勿多)。

3.固定。

4.舌下静脉注入肝素(0.3ml/100g)，目的是抗凝，防止血液在心脏内凝固。舌下静脉的位置很表浅，针头刺得应比较表浅，不要扎得太深。(或者可以在冰盘中加入肝素抗凝，把心脏放入冰盘后，轻轻摇动冰盘，达到充分抗凝的目的)

5.开胸：画图讲述

找到剑突的位置，在剑突的水平剪开腹部的皮肤和肌层，这样腹腔就暴露出来了，再沿着前胸壁剪断膈膜，沿两侧腋前线，把肋骨向上平行剪开，翻起前胸壁，暴露心脏。

6.用镊子提起心脏根部，用剪刀尽量靠近头端（即远离心脏）剪断血管，目的是尽量保留较长的主动脉。(剪的时候可以连带肺脏一起剪下来)。放到4℃的生理盐水平皿中使心脏停搏。

7.在平皿中，找到主动脉的位置（判断方法：主动脉有多个分支），并进行修剪经主动脉把心脏挂在灌流装置上，用动脉夹夹住，然后用线结扎。

注意：挂之前要把灌流液打开，排出灌流装置中的气泡，另外主动脉插入的位置不能太深，同学们考虑一下是什么原因。

8.打开灌流液行逆向灌流，心脏很快恢复自主跳动。

9.插入球囊：关闭灌流液，剪去一部分左心耳，注意这个口不要剪太大防止漏气。把球囊通过左心耳、房室瓣插到左心室里。

如何判断左心耳的位置？心脏有两面，一面突起，一面是平的，把平的这一面朝前，正对着我们的就是左心耳。球囊插入左心室时穿过房室瓣时有一种豁空感。

10.在仪器的监测下，向球囊内注入生理盐水，使左室的舒张末期压调整在0～10mmHg之间，同学们要注意在这个舒张压的时候，注射器的刻度在哪里。

11.预灌注3分钟，观察心率、心室内压、±dp/dt_max(左室最大收缩或舒张速率)等指标。

12.各组都要观察一下增加心脏的前负荷对心脏功能的影响。在仪器的监测下，将左心室舒张末压调整到15-20mmHg，观察心功能有什么变化。

13.分组实验：

观察药物对心脏功能的影响(1组和2组)：西地兰灌流液5min→恢复正常灌流液→异丙肾上腺素灌流液1min→恢复正常灌流→心得安灌流液5min→立即换为异丙肾上腺素灌流液1min→立即换为西地兰灌流液5min→恢复正常灌流。

观察温度和离子对心脏功能的影响(3组)：无钙灌流液20s→恢复正常灌流→温度升高到39℃(43℃)→恢复至正常温度→高钙灌流液灌流1-2min→恢复正常灌流液

缺血/再灌注损伤(4组)：停灌60min→恢复灌流20min→观察心功能的变化。

实验操作中应注意的问题：

1．麻醉不要太深；

2．开胸取心的速度要快；

3．保留较长的主动脉；

4．挂心脏之前勿忘排气泡；

5．主动脉挂的位置不要太深；

6．左心耳不要剪太多；

7．换液时要注意排气泡。

实验结果(Results and conclusion)

1．药物对心脏功能的影响

用西地兰灌流应表现为：HR↓，±dp/dt_max↑，左室内压↑

西地兰是正性肌力药物，对心脏的作用包括：(1)加强心肌收缩力(正性肌力作用)；(2)减慢心率(负性频率作用)。西地兰增加心肌收缩力的机理：增加心肌细胞内可利用的Ca²⁺而发挥正性肌力作用。Ca²⁺增加的原因，心肌细胞膜的Na⁺、K⁺-ATPase是强心苷的受体。强心苷可以与Na⁺、K⁺-ATPase的α亚单位结合，而抑制其对Na⁺、K⁺的转运功能，使细胞内Na⁺增加，降低了膜内外Na⁺浓度梯度，而抑制了Na⁺/ Ca²⁺交换，使Ca²⁺排出受到影响，细胞内Ca²⁺增加而发挥正性肌力作用。

用异丙肾上腺素灌流应表现为：HR↑，±dp/dt_max↑，左室内压↑

异丙肾上腺素是β受体激动剂(β₁、β₂激动剂)，作用于心脏的β₁受体，表现为正性肌力和正性频率作用，心率加快，心肌收缩力增强。

用心得安灌流应表现为：HR↓，±dp/dt_max↓，左室内压↓

心得安(普萘洛尔)是β受体阻断剂，对β₁和β₂受体的选择性低，能减慢心率，降低心肌收缩力和心输出量，血压降低。

用心得安阻断β受体后，再应用异丙肾上腺素不会表现出正性肌力和正性频率作用，而应用西地兰仍可表现出应有的作用，因为西地兰并非通过激动β受体发挥正性肌力作用。

2．用无钙灌流液灌流心脏，心肌细胞内Ca²⁺的浓度降低，心肌兴奋-收缩耦联过程发生障碍，心肌收缩力减弱、心率减慢，甚至于心跳停止；用高钙灌流液灌流心脏，心肌细胞内Ca²⁺浓度升高，导致心脏停跳在收缩期，出现钙僵。

3．灌流液的温度升高，可以直接刺激窦房结，使心率加快，心肌收缩力↑

4．缺血/再灌注损伤：缺血较长时间后恢复灌流，可以出现比单纯缺血更严重的损伤，其机制与氧自由基的产生，钙超载，中性粒细胞呼吸爆发等有关，心功能表现为再灌注性心律失常，心肌收缩，±dp/dt_max降低。