Impact factor: 9（2024）

Published online：2024-7-15 

研究背景

上皮细胞粘附分子（Epithelial Cell Adhesion Molecule，EpCAM）是一种糖蛋白，通过其细胞外（EpEX）和细胞内（EpICD）结构域参与多种与癌症相关的细胞功能，其高表达与结直肠癌（Colorectal Cancer ，CRC）患者预后不良相关。

Wnt是一组分泌型糖蛋白，通过与细胞表面的受体结合来传递信号。在CRC中，Wnt激活可引起EpICD和β-Catenin一起转移到细胞核中，从而调节EpCAM靶基因的转录，但EpICD是否调节Wnt信号尚不清楚。

本研究探讨了EpCAM在Wnt受体表达和信号通路中的作用及其在结直肠癌进展中的影响，并评估了hEpAb2-6（EpCAM人源抗体，可与EpCAM蛋白结合，阻止其降解，从而阻断EpCAM介导的信号传导）的治疗潜力。 

研究结果

1.CRC肿瘤组织中EpCAM与Wnt受体表达呈正相关 

研究者通过免疫组化（IHC）发现，CRC肿瘤组织中EpCAM和活化β-Catenin的水平较健康组织高，且两者表达水平具有相关性（图a~d）。通过分析TCGA数据库，发现EpCAM与Wnt受体FZD6和LRP5/6的表达水平正相关，但与FZD7不相关。 

2.EpCAM调控Wnt受体蛋白表达 

研究者在CRC细胞系中敲除EpCAM后发现，Wnt受体在蛋白和mRNA水平上显著减少。通过将野生型EpCAM质粒转染回敲除细胞，可以恢复Wnt受体的表达，暗示EpCAM可能调控Wnt受体的表达（图f~i）。 

研究者使用hEpAb2-6处理CRC细胞（HCT116、HT29），结果发现Wnt受体的蛋白和mRNA水平显著下降（图j、k）。研究者进一步使用患者衍生的类器官(Patient-Derived Organoids，PDOs)进行实验，发现hEpAb2-6处理CRC PDOs可以显著降低Wnt受体的表达(图l~o)。

3.Wnt受体蛋白表达与EpICD核转移相关

有研究表明，EpCAM的许多细胞效应依赖于EpICD的核转移和EpCAM靶基因的转录促进。加上本研究发现EpCAM参与Wnt受体蛋白表达，研究者假设EpICD可能作为Wnt受体的转录共因子。

并使用γ-分泌酶（γ-secrstase,细胞内蛋白酶复合体,可水解EpCAM，释放EpICD进行核转移）的小分子抑制剂DAPT处理CRC细胞。结果发现DAPT处理降低了EpICD水平及Wnt受体的表达（图a、b）；在EpCAM质粒中引入能够抵抗γ-分泌酶活性的突变（EpCAM-MT），也会减少Wnt受体的表达(图c、d)；将野生型EpCAM或仅EpICD质粒转染回敲除细胞，可以恢复Wnt受体蛋白的表达(图e、f)。 

研究者还利用患者衍生的异种移植瘤（Patient-Derived Xenograft,PDX）模型来研究EpICD的功能，发现hEpAb2-6处理减少了肿瘤中EpICD的核积累，并显著抑制了Wnt受体蛋白水平。

综上，FZD6和LRP5/6表达上调与EpICD核转移相关。 

4.Wnt信号激活诱导γ-分泌酶产生活性 

研究者使用EpEX-his（Expi293表达系统）和Wnt配体（Wnt3A）处理CRC细胞，结果发现两者均能引起γ-分泌酶的核心催化亚基PS2磷酸化，显著增强γ-分泌酶活性（图a,b）。γ-分泌酶激活后水解EpCAM，释放EpICD进行核转移（图e~h）。这一过程涉及β-Catenin破坏复合体(β-Catenin蛋白稳定性和功能的关键蛋白复合体)中的GSK3β和CK1激酶的参与（图h）。

综上，Wnt配体（Wnt3A）激活Wnt信号后促进EpCAM的裂解和EpICD核转移，而EpICD核转移会引起Wnt受体的表达上调，形成正反馈循环。 

5.EpICD与Wnt受体的启动子作用诱导Wnt受体转录 

研究者构建了含有Wnt受体（FZD6和LRP5/6）启动子控制的荧光酶（luciferase）表达的报告载体，通过转染野生型EpCAM质粒，发现荧光酶的表达增强，而DAPT处理则阻断了这一效应（图a,b），在PDOs中进行的类似实验也得出了一致的结果。 

此外，EpCAM敲除的CRC细胞表现出Wnt受体启动子活性降低，这种活性可以通过转染EpCAM-WT和EpICD质粒而恢复（图e,f），hEpAb2-6抗体处理显著降低了PDOs中的Wnt受体启动子活性（图g）。 

6.EpICD刺激Wnt活性诱导CRC进展 

研究者使用EpCAM基因敲除的CRC细胞和对照组细胞建立细胞系异种移植模型（Cell Line-Derived Xenograft, CDX）。结果发现EpCAM基因敲除的细胞形成的肿瘤较小，生长速度减慢（图a~d）。通过IHC和TOP-Flash报告基因检测法，研究者证实EpCAM基因敲除减少了β-Catenin的核转移和Wnt活性，而这些效应可以通过EpICD质粒的转染部分恢复（图e~h）。 

7.hEpAb2-6抑制CRC PDX荷瘤小鼠肿瘤进展 

研究者使用CRC PDOs构建皮下CRC PDX模型，使用带荧光素酶的HCT116 细胞构建原位CRC PDX模型，并使用hEpAb2-6进行治疗。结果显示，两种PDX模型中均减缓了肿瘤生长并延长了动物生存期（图c~h）。 

结论

EpCAM的细胞内域EpICD通过与Wnt受体（FZD6和LRP5/6）的启动子相互作用，增强了Wnt受体的转录和表达，从而激活Wnt信号通路。这一激活又反过来促进了γ-分泌酶的活性，导致更多的EpICD产生和核转移，形成了一个促进肿瘤进展的正反馈循环。

研究还发现，hEpAb2-6抗体能够抑制EpICD的产生和Wnt受体的表达，从而在结直肠癌的临床前模型（PDOs、CDX、PDX）中显示出显著的治疗效果，为开发新的治疗策略提供了重要的分子靶点。 

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南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。 

REFERENCE：

Panda SS, Lee CC, Geevimaan K, Chen KC, Yang SH, Shen CN, HuangFu WC, Wu HC. Intracellular domain of epithelial cell adhesion molecule induces Wnt receptor transcription to promote colorectal cancer progression. J Biomed Sci. 2024 Jul 15;31(1):72. doi: 10.1186/s12929-024-01057-y. PMID: 39010070; PMCID: PMC11247908.