Impact factor: 4.9（2024）

Published online：2024-2-17 

研究背景

非小细胞肺癌（non small cell lung cancer， NSCLC）约占所有肺癌病例的85%，预后较差。EGFR-TKIs（表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂）作为NSCLC患者的靶向治疗手段，具有显著抗肿瘤效果，但许多患者最终会发展出对EGFR-TKIs的获得性耐药，导致肿瘤复发、治疗失败和生存期缩短。

70 kDa核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）在调节细胞生长、增殖和蛋白质合成中起重要作用。在此前的研究中发现S6K1与EGFR-TKI获得性耐药性有关，而在NSCLC中，S6K1与EGFR-TKIs耐药性的关联尚不清楚。

鉴于EGFR-TKIs在NSCLC治疗中的重要性，以及获得性耐药对治疗效果的限制，本研究通过建立Gefitinib（吉非替尼，一种EGFR-TKIs药物）获得性耐药的患者源性异种移植（Patient-Derived Xenograft, PDX）模型来探究EGFR-TKIs耐药机制的产生。 

研究结果

1.建立吉非替尼耐药的NSCLC PDX模型及原代细胞 

研究者通过多次给药使NSCLC PDX模型获得吉非替尼治疗抗性（图A），并通过体内外药敏实验证明耐药性的存在。

研究者使用高剂量吉非替尼（100mg/kg）分别治疗两组NSCLC PDX荷瘤小鼠（亲本PDX和耐药PDX），结果发现亲本PDX组小鼠肿瘤生长受到抑制，而耐药PDX组肿瘤体积显著增加（图B）。

研究者从亲本和耐药PDX肿瘤中分离出原代细胞（分别命名为PDX-P和PDX-R），并使用梯度药物浓度进行药物敏感性实验。结果发现PDX-R细胞对吉非替尼的敏感性较低，IC50值更高（图C）；细胞存活率更高（图D）；凋亡率更低（图E）。

2.S6K1与NSCLC产生吉非替尼获得性耐药有关

在此前的研究中S6K1 在 EGFR-TKI 耐药性中起作用，而在吉非替尼耐药模型中是否也有S6K1的介入还未知。

研究者发现PDX-R细胞的磷酸化S6K1水平增加，表明PDX-R细胞中S6K1活性增强（图A）。研究者使用PF-4708671（S6K1的小分子抑制剂）及吉非替尼处理PDX-R细胞，发现单独使用吉非替尼降低了细胞存活率，而PF-4708671和吉非替尼联合显著降低了细胞存活率，表明抑制S6K1活性可以提高吉非替尼对PDX-R的抗肿瘤效果（图C,D）。

研究者通过转染干扰质粒siRNA靶向敲低PDX-R细胞中的S6K1（siS6K1，图F），通过与转染对照组相比，siS6K1组PDX-R细胞的吉非替尼IC50值明显下降，细胞存活率显著下降（图H），细胞凋亡率显著增加（图I）。同时研究者使用PC9G细胞（肺腺癌细胞PC9吉非替尼耐药的衍生细胞系）进行平行实验也得到了相似的实验结果。

3.MTOR通过上调S6K1表达，促进NSCLC产生吉非替尼耐药

MTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白） 是 S6K1 的调节因子，在蛋白质合成和翻译中起作用，MTOR 已被报道参与多种癌症的 EGFR-TKI 获得性耐药的产生过程 。

研究者发现PDX-R（图A）和PC9G（图B）细胞中的总MTOR和磷酸化MTOR均上调，表明MTOR活性增加。通过转染干扰质粒siRNA靶向敲低PDX-R细胞中的MTOR，与转染对照组相比，siMTOR组PDX-R细胞中S6K1及磷酸化S6K1水平均显著下降（图C）。使用吉非替尼处理siMTOR组和转染对照组的PDX-R细胞，结果显示siMTOR组PDX-R细胞的吉非替尼IC50值明显下降（图D），细胞存活率显著下降（图E），细胞凋亡率显著增加（图F）。同时研究者使用PC9G细胞进行平行实验也得到了相似的实验结果。

综上，靶向敲低MTOR可以降低S6K1的表达，从而提高吉非替尼对耐药NSCLC PDX的抗肿瘤效果。

4.ELK1通过调节MTOR的转录水平介导NSCLC产生吉非替尼耐药

通过JASPAR数据库分析发现MTOR启动子区域中发现了多个潜在的ELK1（一种转录因子，广泛参与肿瘤发生、肿瘤发展和耐药性产生）结合位点（图A）。ChIP-PCR【染色质免疫沉淀聚合酶链式反应，用于研究蛋白质与DNA相互作用的分子生物学技术】检测表明ELK1与MTOR启动子结合（图 I）。

与PDX-P细胞相比，PDX-R细胞中ELK1的mRNA和蛋白质水平上调（图B）。通过TCGA数据库分析发现，在包括肺腺癌和肺鳞状癌在内的大多数癌症类型中，ELK1表达与MTOR表达之间存在正相关。通过转染干扰质粒siRNA靶向敲低PDX-R细胞中的ELK1，可下调MTOR和S6K1蛋白表达水平（图 E）并下调 MTOR mRNA含量（图 F）。

研究者进一步进行了双荧光素酶报告基因测定。ELK1的过表达（图J）显着增加了PC9细胞中MTOR报告基因的荧光素酶活性，而在PC9G细胞中沉默ELK1导致MTOR报告基因的荧光素酶活性降低，表明ELK1直接促进MTOR的转录（图K）。研究者对siELK1组和转染对照组PDX-R细胞进行吉非替尼处理，发现siELK1组吉非替尼的IC50降低（图L），细胞活力显着降低（图M）。

综上，ELK1表达增加可上调MTOR的基因转录水平，从而增加MTOR蛋白表达，MOTR进一步促进S6K1的激活，最终介导NSCLC PDX对吉非替尼耐药。

结论

研究发现，转录因子ELK1通过直接结合MTOR基因的启动子区域并增强其转录活性，从而调控MTOR的表达，而MTOR的活性上调促进了S6K1的激活，最终导致NSCLC产生对吉非替尼的耐药。

这些结果表明，靶向ELK1/MTOR/S6K1信号通路可能为克服NSCLC对EGFR-TKIs的耐药性提供了一种有效的治疗策略，有助于改善患者的治疗结果，并为未来的临床研究和药物开发指明了方向。 

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公司简介：

南昌乐悠生物科技有限公司是一家专业从事肿瘤动物模型构建及抗癌新药临床前药效评价的国家高新技术企业，已经为包括小分子靶向药、大分子靶向药（包括ADC）、溶瘤病毒、细胞药物（TIL、γδT）等多种抗癌新药研发提供了有力的支持，其中部分药物已经进入临床试验申请(IND)阶段。 

REFERENCE：

Zhao L, Wang Y, Sun X, Zhang X, Simone N, He J. ELK1/MTOR/S6K1 Pathway Contributes to Acquired Resistance to Gefitinib in Non-Small Cell Lung Cancer. Int J Mol Sci. 2024 Feb 17;25(4):2382. doi: 10.3390/ijms25042382. PMID: 38397056; PMCID: PMC10888698.