Y 盒结合蛋白（Y-box binding protein，简称Ybx）是一种通过与DNA或RNA结合来调控基因表达的蛋白质家族，主要成员包括 Ybx1和Ybx2。在小鼠中的研究表明，Ybx1蛋白对于胚胎的正常发育至关重要，而Ybx2则主要在性腺发育过程中发挥重要作用。有趣的是，与小鼠等动物不同，斑马鱼中仅存在Ybx1，而缺乏性腺特异的Ybx2。澳门大学葛伟研究团队的前期研究表明，斑马鱼的 Ybx1 蛋白主要集中表达在性腺尤其是卵巢中，类似于哺乳动物的Ybx2。进一步的实验显示，斑马鱼卵巢中的Ybx1蛋白主要集中表达在初级生长（primary growth, PG）阶段的卵泡中，但其水平在卵黄生成前期（previtellogenic, PV）的卵泡中出现急剧下降，并在卵黄生成期（vitellogenic, V）的卵泡中逐渐消失。这一发现表明，Ybx1蛋白可能在斑马鱼卵泡的早期发育中起着关键作用[1]。

卵泡是卵巢的基本结构和功能单位，由一个卵母细胞（oocyte）和围绕它的卵泡细胞（follicle cells）组成。2024年11月8日，葛伟团队在Development杂志上发表了题为“Y-box binding protein 1 regulates zebrafish folliculogenesis partly through p21-mediated control of follicle cell proliferation”的文章，用遗传分析的方法探讨了Ybx1蛋白在斑马鱼卵泡发生中的重要性及其作用机制。

研究团队使用TALEN技术敲除了斑马鱼中的ybx1基因，发现ybx1突变型（ybx1-/-）斑马鱼有明显的胚胎致死性，大多数胚胎在发育早期死亡，但仍有少数个体能够存活至成年。然而，这些存活的ybx1-/-斑马鱼的卵泡发育大多停滞在卵黄生成前期（previtellogenic stage, PV），仅有少数卵泡能够完成生长和成熟过程，导致产卵能力显著下降。和前期的研究结果一致，这些ybx1-/-雌鱼所产卵子因为母源效应，无法完成正常的胚胎发育[2, 3]。

图1 Ybx1的缺失导致卵巢发育不良，卵泡发生阻滞在卵黄生成前期

该项研究集中聚焦在早期卵泡发生的阻滞及其机制。实验结果表明，ybx1-/-突变型斑马鱼PV卵泡中的p21（cdkn1a）蛋白和mRNA水平显著升高。p21是一种细胞周期抑制蛋白，其水平的升高可能导致细胞分裂增殖受阻，进而影响卵泡的正常发育。为了验证这一假说，研究团队进一步使用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼中的cdkn1a基因。结果显示，cdkn1a完全敲除的斑马鱼（cdkn1a-/-）存活率极低，约为0.27%。因此，研究团队主要使用cdkn1a杂合子斑马鱼（cdkn1a+/-）进行后续实验。结果显示，cdkn1a+/-斑马鱼的卵泡激活（PG-PV 过度）显著早于野生型对照（cdkn1a+/+），且更早完成卵泡生长过程，但也在后期表现出卵巢早衰现象和排卵能力的下降。

图2 Ybx1的缺失显著地降低卵泡细胞的分裂增生。（A）体外培养的Ybx1突变体卵泡细胞的增生能力明显降低。（B）BrdU标记显示 Ybx1突变体卵泡细胞的体内增生明显降低。（C，D）p21(cdkn1a)的表达在 Ybx1 突变体卵泡中明显上调。

研究团队随后分析了同时敲除ybx1和cdkn1a的双突变型斑马鱼（ybx1-/-;cdkn1a-/-）。结果显示，cdkn1a-/-可以明显拯救ybx1-/-导致的卵泡发育停滞，使得卵泡可以正常进入卵黄生成期。进一步的 实验表明，来自不同基因型的 PV卵泡细胞在体外培养中表现出明显的增殖差异。来自ybx1-/-的卵泡细胞和对照相比有很低的分裂增殖能力，而来自cdkn1a+/-的卵泡细胞则具有明显增强的增生能力。有趣的是，ybx1-/-;cdkn1a+/-组合的卵泡细胞全面恢复了分裂增生能力并且比对照有所增强。

图3 p21（cdkn1a）的缺失可以拯救 Ybx1 缺失导致的卵泡发育阻滞，恢复卵黄生成和累积。PG, primary growth 初级生长期; PV, previtellogenic stage 卵黄生成前期; V, vitellogenic stage 卵黄生成期。

基于以上实验结果，研究团队提出了以下结论：（1）Ybx1蛋白对早期卵泡发育至关重要，特别是在从卵黄生成前期（PV）向早期卵黄生成期（early vitellogenic, EV）过渡的过程中。（2）Ybx1蛋白控制早期卵泡发生的主要作用之一是抑制p21（cdkn1a）的表达，从而有助卵泡细胞的分裂增生，这一机制对保证卵泡的正常激活和快速生长至关重要。

图4 p21（cdkn1a）的部分缺失（cdkn1a+/-）可以拯救 Ybx1 突变导致的卵泡细胞分裂增生的缺陷。（A，B）不同基因型 PV卵泡细胞的体外增殖。（C，D）不同基因型 PV卵泡细胞体外增殖的定量分析。（E）不同基因型卵泡细胞中的 Ybx1 蛋白表达。  

该研究不仅深化了对斑马鱼卵泡发育调控机制的理解，也为研究相关人类疾病如卵巢早衰等提供了新的视角。

论文的第一作者是澳门大学的博士后研究员朱波，通讯作者为葛伟教授。