墨西哥钝口螈作为再生、发育和进化生物学研究的重要模式生物，其应用前景广阔。然而，缺乏高效、精准的遗传操作工具限制了其分子机制的深入研究。传统的基于同源重组(homology-directed recombination, HDR)的基因敲入策略整合效率相对较低，仅约2%。虽然基于CRISPR/Cas9技术的同源非依赖性靶向基因敲入(homology-independent knock-in, HIK)方法已在蝾螈中建立，能实现较高的敲入效率，但这种方法通常会在整合位点形成“疤痕”，即局部序列的删除或插入。

2025年3月7日，Journal of Genetics and Genomics在线发表广东省人民医院费继锋教授和华南师范大学刘彦梅研究员团队合作题为“Establishing a semi-homology-directed recombination method for precision gene integration in axolotls”的研究论文。该研究开发了一种CRISPR/Cas9介导的半同源定向重组(semi-HDR)基因敲入方法，能够高效地将外源基因以5'端精准敲入的形式整合到蝾螈基因组位点。基于该方法构建了一系列用于标记及示踪脊髓神经前体细胞亚型的转基因蝾螈品系，揭示了Nkx2.2+细胞在发育和再生中不同的分化倾向。

该研究开发了一种CRISPR/Cas9介导的semi-HDR敲入方法，利用单个同源臂将Cherry报告基因和诱导型Cre重组酶(约4 kb)高效且单端精准地整合到蝾螈多个基因组位点(包括Sox2、Neurod6、Nkx2.2和FoxA2)。Semi-HDR介导的靶向基因插入比传统的HDR方法效率更高，在Cherry基因敲入实验中，使用semi-HDR构建转基因动物的效率可达到10%–15%(HDR方法效率约为2%)。该研究利用semi-HDR构建了一系列标记脊髓神经前体细胞亚型的转基因蝾螈品系，包括基于Sox2、Neurod6、Nkx2.2和FoxA2位点的荧光报告品系以及可诱导重组酶CreER转基因品系。进一步利用Nkx2.2:CreER品系结合报告基因转基因蝾螈，该研究比较示踪了脊髓p3神经祖细胞在发育以及再生中的命运，发现在发育过程中Nkx2.2+细胞倾向分化形成少突胶质细胞，而在再生中趋向于生成运动神经元，揭示了同种祖细胞在发育及再生中的功能差异。

A：利用semi-HDR方法将质粒pGEMT-Nkx2.2-P2A-memCherry-Cre-ERT2-PA在5'端连接处无瘢痕整合到Nkx2.2位点；B–G：在明场和CHERRY荧光通道下Nkx2.2:memCherry-Cre-ERT2转基因动物的头部和尾部荧光表达情况；H：Nkx2.2:memCherry-Cre-ERT2转基因动物尾部横切面的免疫染色情况。

综上所述，该研究开发的semi-HDR基因敲入方法平衡了基因整合的效率和精确度，为进一步构建组织器官再生研究所需基因敲入蝾螈提供了重要的、有价值的工具，此方法也可扩展到其他非经典模式物种。

华南师范大学脑科学与康复医学研究院博士研究生王丽群、广东省人民医院博士后胡燕为该论文共同第一作者。广东省人民医院费继锋教授、华南师范大学脑科学与康复医学研究院刘彦梅研究员为该论文共同通讯作者。相关工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目资助。