目的 开发 α-1，3 半乳糖苷转移酶基因敲除 （α-1，3-galactosyltransferase gene-knockout，GTKO） /人 CD55 （human CD55 ，hCD55） 转基因的基因编辑异种器官移植供体猪并进行功能验证。

方法 利用成簇的规律 间隔的短回文重复序列 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR） /CRISPR相关蛋白 核酸酶9 （CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）、PiggyBac转座子技术和体细胞克隆技术，构建GTKO/hCD55 基因编辑的滇南小耳猪，通过Sanger测序、实时荧光定量PCR、流式细胞术、免疫荧光实验、重亚硫酸盐测序、 抗原抗体结合实验和补体依赖的细胞毒性实验分析其表型及功能。

结果 将基因编辑载体PX458和PiggyBac转染 至野生型胎猪成纤维细胞后，经嘌呤霉素药物筛选获得48个单细胞克隆，挑选2个单细胞克隆进行体细胞克隆，获 得2个妊娠33 d的胎猪。F01胎猪的α-1，3-半乳糖基转移酶 （α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1） 基因型为−17 bp 和野生型 （wild type，WT），F02胎猪的GGTA1基因型为−26 bp/+2 bp和−3 bp。两个胎猪的hCD55 mRNA表达量 均显著高于WT猪 （P＜0.01），以F02胎猪作为供体细胞来源进行连续克隆后获得11头存活仔猪，鉴定均为GTKO/ hCD55基因编辑猪。这些猪的α-Gal抗原表达缺失，但hCD55出现弱表达或不表达的情况。因此，对hCD55基因 的 CpG 岛进行甲基化分析，结果表明在不表达 hCD55 的肾脏组织中 hCD55 基因的 CpG 岛被高甲基化，而表达 hCD55的肾脏组织中hCD55基因的CpG岛未被甲基化或部分被甲基化。对hCD55基因的CpG岛进行密码子优化 降低CG含量后，可实现hCD55基因的稳定表达。此外，抗原抗体结合实验表明人IgM结合到GTKO/hCD55基因编 辑猪成纤维细胞的数量显著小于WT猪 （P＜0.01）；补体依赖的细胞毒性实验表明GTKO/hCD55猪的成纤维细胞成 活率明显高于WT猪 （P＜0.01）。

结论 成功获得了GTKO/hCD55基因编辑异种器官移植供体猪，并通过密码子优 化降低了hCD55基因CpG岛的CG含量，从而有效避免甲基化导致的基因表达沉默。本研究可为供体猪的开发提 供借鉴，将指导后续异种器官移植研究。

阅读原文：GTKO╱hCD55基因编辑异种器官移植供体猪的构建及功能验证.pdf