暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院杨伟莉、李世华及李晓江团队在Journal of Clinical Investigation在线发表题为Deficiency of Parkin causes neurodegeneration and accumulation of pathological α-synuclein in monkey models的研究论文。

该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了不同年龄的Parkin缺失猴模型,发现Parkin缺失对猴大脑早期发育中的神经细胞存活无明显影响，但随年龄增长会造成猴中脑黑质多巴胺神经细胞的明显变性及死亡、纹状体部位多巴胺合成减少及病理性pS129-α-syn聚集（图1和图2），成功模拟了PD病人脑中的重要病理特征，这与Parkin敲除的小鼠模型及猪模型无法模拟PD病人脑中神经细胞退变死亡的重要病理形成鲜明对比，提示利用非人灵长类动物模型研究Parkin功能的重要性和必要性。

图1. （A）猴脑注射AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9敲除Parkin基因。（B， C）免疫组化染色证明在Parkin基因打靶后猴脑黑质区多巴胺神经细胞（TH）出现明显退变死亡，且在年老（25岁）猴中的神经细胞死亡更为严重。（D）电镜结果显示，Parkin敲除可造成猴中脑黑质神经细胞的退变死亡及髓鞘退化。（E）FDOPA PET结果显示敲低猴脑黑质Parkin可显著减少纹状体部位多巴胺的水平。（Credit: Journal of Clinical Investigation）

图2. Parkin敲除可造成猴中脑黑质出现病理性pS129-α-syn聚集。（A）免疫组化染色显示Parkin敲除可在猴黑质中造成pS129-α-syn表达增加，且随着衰老这种蛋白聚集更为显著。（B）高倍镜图显示毒性α-synuclein蛋白形成路易小体。（C）对A图的聚集体进行统计。（D）在老年（25岁）猴脑黑质神经细胞的胞内及胞外均有病理性pS129-α-syn聚集体形成。（Credit: Journal of Clinical Investigation）

有研究报道Parkin Ser65突变同样可造成PD发生。大量体外研究发现PINK1可在Ser65位点磷酸化激活Parkin，但由于PINK1蛋白在生理状态下的小动物脑内及常见细胞系中因表达较低而检测不到，因此尚无生理状态下的体内证据证明PINK1介导Parkin的磷酸化。而该团队前期研究发现PINK1激酶在灵长类脑中特异性丰富表达，在本研究中进一步发现敲除PINK1基因可明显减少磷酸化Parkin(pS65-Parkin)表达并伴随出现由pS129-α-syn蛋白聚集而成的路易氏小体，该研究首次揭示了在生理状态下的动物体内PINK1可磷酸化Parkin的证据, 且Parkin 磷酸化的减少与pS129-α-syn蛋白的聚集相关。这为携带PINK1及Parkin突变的PD患者在临床上具有相似的表型提供了新的分子机制。

为了进一步验证PINK1介导的Parkin磷酸化在猴脑中的重要功能，该研究对野生型Parkin蛋白的Ser65位点进行突变（S65A）使得其不能被PINK1磷酸化。结果发现，过表达野生型PINK1和Parkin均可通过增加Parkin磷酸化水平而减少老年猴脑中病理性α-synuclein蛋白的聚集，从而发挥神经保护作用。而过表达不能被PINK1磷酸化激活的Parkin突变体 (S65A) 则不能有效清除α-synuclein蛋白的毒性作用。此外，该研究也在散发性PD患者脑组织中验证了在猴脑中的现象，发现散发性PD患者脑中磷酸化Parkin水平表达下调，且在正常衰老的猴脑中可溶性Parkin磷酸化蛋白的表达也出现明显下调，提示衰老可能是引发磷酸化Parkin功能下调从而介导脑功能异常的一个重要因素（图3）。综上，该研究利用灵长类动物模型揭示了PINK1激酶介导的Parkin蛋白磷酸化在衰老和PINK1、Parkin基因突变引发的PD中的重要保护作用，为PD的临床治疗提供了新的潜在靶点。

图3. 磷酸化Parkin在PD病理中的重要机制模型。衰老、PINK1和Parkin基因突变均可导致磷酸化Parkin的减少, 从而导致包括毒性α-synuclein蛋白的累积及神经细胞死亡（Credit: Journal of Clinical Investigation）

值得注意的是，与PINK1缺失猴模型不同，Parkin缺失对猴大脑早期发育中神经细胞功能未见明显影响，这可能是由于PINK1作为上游激酶还参与调节其它重要底物。比如，该团队还利用新鲜野生型猴脑组织进行蔗糖密度梯度离心法分离不同亚细胞器，发现PINK1和Parkin蛋白具有不同的亚细胞定位（Liu et al， Neural Regen Res 2024），也提示PINK1、Parkin蛋白除了通过Parkin磷酸化发挥功能之外，可能还有各自独立的功能。