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全身炎症三种动物模型的比较

2017年12月05日 浏览量: 评论(0) 来源:Journal of Biomedical Science December 2017, 24:60 | Cite as 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:为了模仿人类的全身炎症,已经研制出不同的动物模型。由于这些模型仍然是有争议的,我们的目的是比较评估最广泛使用的模型对系统的影响,影响器官的功能和潜在的病理生理过程。
摘要:为了模仿人类的全身炎症,已经研制出不同的动物模型。由于这些模型仍然是有争议的,我们的目的是比较评估最广泛使用的模型对系统的影响,影响器官的功能和潜在的病理生理过程。
 
方法:通过脂多糖(LPS)给药、腹腔污染和感染(PCI)或盲肠结扎穿孔(CLP)对C57BL/6N小鼠治疗诱导全身性炎症反应。在炎症诱导后0, 2, 4、6, 12, 24、48和72小时评估血糖和循环细胞因子水平。此外,还测定了各器官的氧化应激和肝脏的生物转化能力。通过免疫组化法检测肝、脾组织中氧化应激、凋亡、浸润性免疫细胞及细胞因子表达模式。
 
结果:用LPS给药和PCI诱导的小鼠炎症反应非常相似。然而,LPS给药能引起更强的反应。在两种模型中,血清促炎细胞因子水平迅速升高,而血糖下降。器官显示氧化应激的早期迹象,脾细胞凋亡增加。此外,肝脏的生物转化能力降低,肝和脾有明显的免疫细胞浸润。暴露于LPS或PCI的小鼠在72小时后恢复,相反,CLP诱导的炎症反应相对较少,但炎症反应更为持久。
 
结论:当研究急性炎症的新疗法时,全身炎症反应的LPS模型显示最合适。当使用CLP模型模拟人体脓毒症时,给药应采用较长的疗程,因为给药可导致全身炎症的迟发性发展。
 
关键词:  LPS  PCI  CLP  全身炎症反应;氧化应激;细胞因子
 
背景:脓毒症在重症监护病房仍然是一个重大的临床挑战,因为它经常导致多器官功能障碍和高发病率,导致死亡率约为50%。虽然已经制定了治疗潜在感染的既定策略,但迫切需要开发新的治疗方案和确定潜在的候选药物,以预防和打击败血症。为了这些目的,动物模型是非常有用的。为了模仿人类脓毒症的病程,已经研制出各种啮齿类动物模型。这些模型可以分为三大类:内毒素脂多糖(LPS)外源[给药] 外源性病原体的体外给药[接种大肠杆菌],内源性保护屏障破坏[盲肠结扎穿孔模型(CLP)]。这三种模型各有优缺点,其中哪种动物模型最合适,仍存在争议。LPS动物模型具有技术简便、重现性好等优点,特别是在炎症反应中发挥了重要作用。LPS给药后不久,释放出高水平的促炎性细胞因子,并可在循环血清中测定。这导致全身炎症反应综合征(SIRS)和随后的剂量依赖性死亡率迅速发展。然而,LPS模型并没有完全重现人类败血症的特征。LPS可以用来研究内毒素血症或SIRS的病理生理过程,如内毒素休克模型。为了弥补LPS模型的缺点,开发了多种微生物引起的败血症模型。在腹腔感染和感染模型(PCI)中,从健康、非素食捐赠者的粪便样本中分离出各种需氧和厌氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。此外,PCI模型与临床败血症的相关性值得怀疑,因为病人很少有大量菌血症。单一的应用高剂量的细菌引起的效果接近于静脉注射大剂量脂多糖后观察到的结果。使用最广泛的脓毒症是盲肠结扎穿孔(CLP)模型,公认与人类脓毒症有很好的相容性。本研究的目的是全面描述LPS、PCI和CLP小鼠模型在72小时内的特征,包括全身炎症的急性期。为此,诱导了一种不引起急性致死的中度全身炎症反应。因此,没有必要对动物进行任何抗生素治疗或液体复苏,这使我们能够研究这种疾病的自然病程。通过测定血清细胞因子浓度、测定各器官氧化应激参数、追踪脾、肝免疫细胞迁移来评价全身免疫应答。肝功能对患者整体预后至关重要,甚至比肾和肺功能更重要,因此,肝功能参数也被确定。这是第一次直接和全面地比较这三种动物模型,在72小时内,用非致死的方法来研究全身炎症反应对器官功能的影响。本研究的目的是为了更好地理解这些动物模型所涉及的病理生理过程,以帮助研究者选择最合适的模型,并在评价治疗全身炎症反应的候选物时,确定哪些参数对哪一个模型有用。
 
方法:动物和实验方法:成年雄性C57BL/6小鼠(12周龄,体重25–30 g),动物被安置在标准条件下的塑料笼子(光暗周期12 / 12小时,温度22±2°C,湿度50±10%,颗粒饲料自由饮水)。小鼠用脂多糖LPS处理。大肠杆菌,5毫克/公斤体重,溶解在PBS中腹腔给药体积0.1毫升/10克小鼠体重),盲肠结扎穿孔[CLP]。2, 4, 6、12, 24, 48和72小时后所描述的处死动物。在实验开始时(T=0),每治疗组处死四只对照小鼠。这些老鼠没有接受任何治疗。在前几次(试验)研究中确定了最合适的非致死性LPS剂量。小鼠取1.5μg体重的大便,溶于PBS腹腔内给予0.1毫升/ 10克体重,代表非致死剂量。异氟醚诱导麻醉和沿腹白线正中切口切开腹腔,暴露盲肠,在远端与盲肠底之间用不可吸收缝线结扎。随后,使用21g针穿刺盲肠轻轻地压缩挤出少量盲肠内容物。诱导中期的炎症反应,再次缝合腹腔。由于我们对这种疾病的自然病程很感兴趣,因为我们诱发了一种中度的全身性炎症,导致急性致死的可能性很小,在三种动物败血症模型中,没有一种使用抗生素治疗。为了跟踪每个动物模型的病程,在八个不同的时间点进行了调查。0 h(相当于对照组),炎症开始后2小时,4小时,6小时,12小时,24小时,48小时和72小时,处死小鼠(每个时间点处死4 – 6只动物)。在每一个时间点,测量体温,并根据临床严重程度评分(CSS)评估动物的状况,如前所述。每小时评估一次CSS值,并尽一切努力减少动物的痛苦。当动物CSS评分为4时,吸入过量异氟烷处死。所有其他小鼠在所指示的时间点使用同一方法处死。摘取大脑、肾脏、肝脏、肺脏和脾脏,称重,并固定于10%多聚甲醛和快速冷冻在液氮中进行生化分析。小鼠断头后,完全放血,血液收集在凝集管中。用市售血糖仪和相应的试纸测定血糖水平。30分钟后,对凝结的血液2000克离心10分钟获得的血清进行ELISA和酶活性的测量。实验中未发现血清细胞因子和氧化应激水平升高的动物以确保治疗组没有抗药性小鼠。在组织学分析中,福尔马林固定的器官标本植入石蜡块,每个处理组切成4μm的薄片(n=4~6)。
 
白细胞介素(IL)6、白细胞介素(IL)10、肿瘤坏死因子(TNF)-α,干扰素(IFN)-γ,CXC趋化因子12(CXCL12)和丙氨酸氨基转移酶(ALAT)法:使用IL-6的小鼠ELISA试剂盒、TNF-α小鼠ELISA试剂盒、IFN-γ小鼠ELISA试剂盒、CXCL12 / SDF-1α小鼠ELISA试剂盒和丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒对其进行测定。
 
结果:健康状况,包括血压、体温和体重的测量受LPS、PCI和CLP治疗的影响:每一种动物模型中,我们诱导了一种中度、非致命的全身炎症状态来研究疾病的病程。然而在CLP模型中,一只在24 h后,一只在40小时后和一只70 h后,由于CSS 评分为4不得不被安乐死。因为这些动物不符合所规定的时间点,所以不包括在进一步的分析中。小鼠接受LPS或PCI显示健康状况受损,临床症状严重程度评分(CSS)与对照组相比更为明显。感染诱导6~12小时后达到最大值,随后下降到基线水平。在48 - 72小时后,处理过的小鼠和对照组之间的CSS值没有差异。CLP处理的小鼠在6 - 12小时后也表现出CSS峰值,但与其他两组动物相比,这些值仍升高直到72小时,表明该病病程较长而无恢复。在全身炎症过程中血压和心率变化是至关重要的。在所有三种动物模型中,与对照组相比血压值下降(控制:115•6毫米汞柱,LPS:80•8毫米汞柱,PCI:90•16毫米汞柱,CLP:79•16毫米汞柱),而平均心率增加(对照:446•51 BPM,LPS:591•33 BPM,PCI:514•60 BPM,CLP:554•43 BPM)。与对照组相比,全身炎症也影响体温和体重。LPS、PCI和CLP治疗可降低体温和体重。体温在2至12小时之间显著下降,CLP治疗小鼠的体温下降最大。6 h后,动物体温下降。不同的治疗方式对体重的影响非常相似,因为所有三种动物模型中的老鼠体重24小时均减轻了。24小时后,PCI和CLP治疗的小鼠体重恢复,而LPS治疗组体重在48和72小时后仍比对照组减轻了。
 
脓毒症模型中血糖、血清细胞因子和肝酶水平不同:为了进一步评估LPS、PCI和CLP治疗后的全身结果,我们评估了全血中的葡萄糖水平以及血清中炎性细胞因子的水平。LPS和PCI治疗的小鼠表现出低血糖,在感染后12小时达到高峰。12小时后,血糖水平持续上升,最终恢复到控制水平。在CLP模型中,低血糖也出现了,但与LPS和PCI模型相比,血糖水平在感染后72小时仍保持较低水平。LPS给药后,与对照组相比仅2小时后肿瘤坏死因子(TNF)α水平升高约4500%。与对照组相比,PCI和CLP组使肿瘤坏死因子α浓度分别增加了大约1500%和1000%。然而,CLP组在随后的时间点血清TNF-α水平升高。与TNFα相似,LPS治疗对血清干扰素(IFN)γ水平的影响最强。与对照值相比,各组水平分别在4, 6、12小时显著增加了(分别为25000%、45000%和22000%)。CLP组可使IFN-γ中度升高,但PCI组对血清IFN-γ浓度几乎无影响。检查白细胞介素(IL)- 6浓度,LPS给药导致血清IL-6水平的早期升高,特别是感染后2, 4小时和6小时。PCI治疗的小鼠的血清水平也有相似的增长。CLP组也导致细胞因子的早期升高,比LPS或PCI模型中增加的要少。CLP组IL-6浓度仍然比对照组高出约5000%。为了探讨代偿机制,还测定了血清IL-10浓度。在这里,三种动物模型引起不同的结果。LPS处理诱导双相IL-10的反应,2小时后大幅度增加,其次是一直减少至12小时, 24小时后二次升高。PCI治疗导致IL-10水平连续增加达6小时的,其次是逐步减少,而CLP组小鼠表现出在稍后的时间点IL-10水平升高。在LPS给药的小鼠,CXCL12水平持续下降,至24小时后,炎症发作,其次是在稍后的时间点增加。与对照组比较,PCI组诱导双相反应,4 h后CXCL12水平较低,24 h后水平增加。CLP治疗导致24和48 h血清CXCL12水平升高。
 
三种全身炎症模型均影响肝功能:因为所有组的ALAT水平升高,需进一步检查肝功能。H E和周期性酸性希夫染色(PAS)染色分析肝组织切片。HE染色显示LPS处理的小鼠肝脏在24小时后出现大量脂肪堆积和炎症细胞浸润。虽然PCI和CLP治疗的小鼠没有显示肝脏脂肪堆积,但也发现了浸润细胞。然而,与LPS组相比,浸润较不明显。在确定肝蛋白含量作为细胞色素P450(CYP)模型反应的参考值时,将每个样品的浊度值作为肝脂肪含量的近似值进行评估。与组织学检查一致,LPS处理后的浊度值在4 - 24小时增加。作为衡量肝糖原含量的指标,PAS染色在所有三种动物模型中显示出相似的反应。LPS,PCI,CLP导致肝糖原在6小时后出现明显的损失,但24小时后恢复,72小时达到基准值。作为肝脏氧化应激的附加指标,免疫组化检测血红素氧合酶-1(HO-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。随着治疗时间的延长,HO-1表达增加,72 h后出现明显的表达。相比之下,CLP治疗后,HO-1的表达没有受到影响。在检测iNOS表达时,LPS组和PCI组之间没有显著差异,但PCI效果不如LPS组明显。感染后2小时,LPS导致iNOS阳性嗜中性粒细胞浸润到肝小叶的周围地区。12小时后观察到最大数量的浸润性粒细胞并遍布肝小叶。在稍后的时间点,很少检测到粒细胞。LPS和PCI组对中性粒细胞迁移的影响超过CLP组,在6小时只观察到几个中性粒细胞,且后续没有进一步增加。肝功能的一个核心参数是它的生物转化能力。LPS、PCI和CLP治疗导致肝脏CYP酶活性显著和持续性下降。
 
结论:本研究表明,与CLP组相比,LPS和PCI治疗引起非致命性全身炎症反应对器官功能、细胞因子反应、氧化应激水平和整体健康状况有不同的影响。LPS和PCI模型可引起快速的炎症反应,包括早期血清促炎细胞因子和器官组织氧化应激,血糖值和生物转化能力迅速降低,免疫细胞从血液循环到肝脏和脾脏,并在脾脏凋亡。LPS给药后在所有模型中的炎症反应最强。有趣的是,LPS和PCI处理的小鼠在72小时后恢复,可能是通过诱导保护机制,如HO-1上调。这项研究表明,必须注意系统炎症模型的差异,以确保适当地解决实验目标。这包括评估在检测新的抗炎药物时需要研究的时间。在评估对急性炎症的影响,LPS模型是最合适的,因为全身的影响很容易识别和测量。此外,LPS易于控制,模型重现性好。当然,注射LPS并不完全复制人类败血症的过程,而CLP则是这方面的“金标准”。 然而,这种模式的时间周期必须选择足够长,因为诱导炎症的延迟过程。总之,每一个模型都有好处,必须权衡要研究的实验参数和每个研究的总体目标。
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