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临床前安全研究中非人灵长类动物在限制、采血和给药期间心肌肌钙蛋白I反应的评估

2018年10月29日 浏览量: 评论(0) 来源:Toxicologic Pathology, vol. 45, 2: pp. 335-343. , First Published August 19, 2016. 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:有关心肌肌钙蛋白I(cTnI)作为猴心脏损伤生物标志物的信息已发表。在临床前安全研究中,在常规给药和采血过程中观察食蟹猴的cTnI反应,更好地了解这种反应的发病机制。使用两种不同的方法来测量cTnI,免疫印迹法测定cTnI和肌钙蛋白I超灵敏测定。我们能够证明,在口服、皮下或静脉注射普通载体以及用于静脉穿刺采血的连续猴椅限制之后,两种测定方法都能够检测到cTnI的微小到轻微短暂增加。cTnI值通常在假手术后2, 3, 4或6小时达到高峰,并在22或24小时恢复到基线。此外,在抑制过程中,猴子的心率(HR)和血压(BP)显著增加,这可能在这些动物中引发cTnI释放。猴子非常适应猴椅,并有血管入口进行血液采样,没有明显的HR和BP或cTnI增加。
摘要:有关心肌肌钙蛋白I(cTnI)作为猴心脏损伤生物标志物的信息已发表。在临床前安全研究中,在常规给药和采血过程中观察食蟹猴的cTnI反应,更好地了解这种反应的发病机制。使用两种不同的方法来测量cTnI,免疫印迹法测定cTnI和肌钙蛋白I超灵敏测定。我们能够证明,在口服、皮下或静脉注射普通载体以及用于静脉穿刺采血的连续猴椅限制之后,两种测定方法都能够检测到cTnI的微小到轻微短暂增加。cTnI值通常在假手术后2, 3, 4或6小时达到高峰,并在22或24小时恢复到基线。此外,在抑制过程中,猴子的心率(HR)和血压(BP)显著增加,这可能在这些动物中引发cTnI释放。猴子非常适应猴椅,并有血管入口进行血液采样,没有明显的HR和BP或cTnI增加。
 
关键词:心肌肌钙蛋白I   食蟹猴   生物标志物  心率  限制
 
摘要:心肌肌钙蛋白I(cTnI)更常用于临床前安全性评估研究。有多种出版物,主要是利用大鼠,提示cTnI对急性心肌损伤的作用,以及有限数量的研究表明对慢性损伤的反应。结果证明了在临床前安全性研究中如何有效地利用这种生物标记物来检测心脏损伤。为了在包括NHP在内的所有物种中有效地使用这种生物标志物,应该考虑几个分析因素,以确保对心脏损伤的准确评估。关键的分析因素包括表明分析在有关物种中交叉反应,具有可接受的动态范围,显示出良好的重现性,并显示出极好的灵敏度和特异性。预分析变量,包括采集部位、样品的质量、采样的定时,以及抑制和血样采集的方法,也是准确评估心肌肌钙蛋白反应的关键因素,特别是在NHP研究中。食蟹猴假口服和静脉给药相关的抑制诱导了cTnI的短暂升高。本文目的是进一步表征食蟹猴的抑制作用对CTNI结果的影响。我们还通过测量心率(HR)和血压(BP)来评估这些动物受到抑制后的潜在生理状态,以便更好地理解可能导致cTnI增加的条件。
 
实验动物:猴子饲喂标准的丸化食物,每日两次,并补充蔬菜和/或水果。所有实验都是按照现行的动物福利指南进行的。在实验开始之前,所有的动物都已经适应了抓取和座椅约束。动物进入设施,经过至少一个月的适应期,再将其用于临床前的安全性研究,其中包括社会化和逐步引入操作,椅子的约束,和假程序采用正强化。
 
实验操作:进行了四项独立的研究,评估了座椅约束和赋形剂对cTnI浓度的影响。在第一项研究中,8只雄性猴子(4.9-7.6公斤)用遥测发射器进行座椅限制和口腔灌胃。为了进行遥测手术,在股动脉中放置一个压力导管,并推进到降主动脉,并且通过颈静脉将生物极性心内导联推进到右心室的小梁中用于心电图采集。手术后至少2周的时间允许动物在研究中使用。在研究开始前进行完整的血细胞计数和临床生化,显示无异常。动物接受单一口服剂量(5毫升/千克)的0.5%甲基纤维素和0.1%聚山梨酯80,在给药前(0)和给药后0.5、1、2、4、6和24小时(HPD)取系列血液样品,用免疫印迹法测定肌钙蛋白。猴在0到2HPD取样时间点之间仍留在椅子上,,但在2、4、6和24小时在椅子约束下采集血液后被放回笼子里。虽然这些动物有遥测发射器,但在本研究的血液采集过程中没有评估心血管参数。10只雄性猴子(4.2~6.7kg)静脉注射(9.5ml/kg)或皮下注射(13.3ml/kg)氯化钠(0.9%),每周1次,连续2周(共2次)。这些猴未植入遥测系统。动物置于椅子上,0、2、6和24HPD采集血液样品,用免疫印迹法测定肌钙蛋白。在0-2小时取样时间点之间仍留在椅子上,但在2、6和24小时采集后被送回笼子里。在第三项研究中,对3只雄性猴子(6.6~8公斤)进行了评估。这些猴是通过外科手术肩胛下植入静脉入口的群居动物,这些静脉入口非常适合于操作(约束、给药和采血)。免疫印迹法测定分析前剂量(0)和2, 4, 6,24 HPD血清肌钙蛋白。在0和2HR采样时间之间保持在椅子上,但在2、6和24小时采集后被送回笼子里。在每次采血期间手动获取心率(在每个时间点测定15秒的脉搏率重复3次)。在第1天和第8天静脉滴注氯化钠(0.9%)(9.5 mL/kg)。第四项研究使用了8只雄性猴子(5.7-8.4公斤),这些猴子植入遥测系统(如第一项研究所述)。在研究开始前进行完整的血细胞计数和临床生化组,显示无异常。在他们在笼子里收集大约1小时的基线遥测数据,以便在动物被限制之前建立静息HR和BP值。遥测接收器跟踪猴子从笼子到限制椅子,并在每次限制期间和动物在限制期间返回笼子时连续监测HR和BP。在最初的给药阶段,将每只动物置于约束椅中约20分钟,然后静脉注射0.9%氯化钠(5.2ml/kg)。给药前4天,与给药前(0),药后5分钟,3, 6,和22HPD采集血液样本分析肌钙蛋白I以及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酸激酶(CK)。收集5分钟血样后(在给药时总抑制时间为30分钟),动物返回遥测笼。后续血液取样的节制期较短,每次猴椅限制约10分钟。导出每分钟平均HR和平均BP值。个体平均血压和心率值被计算为用于基线的遥测笼中的60分钟平均值、第一次约束期间的30分钟平均值和3-、6-和22HPD约束过程时的3分钟平均值。数据库的历史回顾包括对来自485只猴子(273只雄性猴子和212只雌性猴子)4年多期肌钙蛋白I检测结果,年龄范围是2至6年。
 
结果:进行了四个独立的研究,评估猴椅约束和赋形剂对cTnI水平的影响。三个研究(研究1、2和4)中的动物接受了椅子约束的标准设施训练,而一个研究(研究3)中的动物接受了更多的训练,并且比其他三个队列更适应椅子约束。在研究1中, 8只食蟹猴口服给药(0.5%甲基纤维素和0.1%聚山梨酯80)。在给药前,以及0.5、1、2、4、6和24HPD采集系列血液样本进行cTnI分析。预检测样品始终低于检测的下限,<0.2 ng/ml。1~6 HPD大多数(5/8)猴子具有可检测的cTnI反应(0.2~1 ng/ml),峰值反应发生在4~6 HPD,并在24 HPD时恢复到<0.2 ng/ml。
 
在研究2中,,10只食蟹猴静脉注射或皮下注射0.9%氯化钠(n=5)。在给药前以及2、6和24HPD采集系列血液样本进行cTnI分析。这是在第1天和8天完成的。从预定样本采集到2-HPD样本采集期间,动物被连续地限制坐椅,并短暂地限制坐椅用于随后的血液采集。在1天和8天,前样品始终低于检测值,<0.2 ng/ml。大多数(4/5)静脉注射的猴子在2和/或6HPD时有可检测的cTnI反应(0.28-1.9ng/ml),峰值反应最常发生在2HPD,在24HPD时返回到<0.2ng/ml。皮下注射(3/5)的猴子在2和/或6HPD时cTnI(0.21-0.48ng/ml)也增加,峰值反应最常发生在2HPD,在24HPD时回复到<0.2ng/ml。
 
在研究3中,3只具有血管通路的猴在第1天和第8天静脉滴注氯化钠(0.9%)(9.5 mL/kg),从预先采集样本到采集2-HPD样本,动物连续地坐在椅子上,并短暂地坐在椅子上,以供随后的血液采集。在第1天之前也进行了预研究样本。在整个取样期间,这些猴的cTnI值均<0.2 ng/ml。这些动物的心率在研究前天最高,每分钟136-211次(BPM),在给药阶段开始时较低(HR在第一天为123-177次,在第8天为124-163次)。
 
在研究4中,食蟹猴在第一天30分钟的猴椅期间静脉注射0.9%的盐水,并且连续测量cTn I浓度、CK、AST和ALT活性。在第4天和第1天的所有猴子在给药后0和5分钟的cTnI低于限定值(0.03纳克/毫升)。大多数猴子(7/8),在3和6HPD时有可检测的cTnI应答,并且这些值范围为0.03至0.43ng/ml。在22 HPD(第2天),所有动物的cTnI浓度低于定量限制。CK值在整个取样期间都是可变的,包括1猴子(动物2)在时间0时的显著升高。最大一致增加发生在6HPD,其中5/8只猴子相对于基线值有增加。在6HPD时,这些动物的值从1265到5087U/L不等,而在第4天,这些动物的值是78到180U/L。AST值也有很大变化,但在6HPD时,4/8只猴子AST值有增加,在22HPD时,AST值保持升高或回到基线。
 
每只猴子在坐椅前1小时在笼内用遥测法测量心率和血压平均分别为116±22BPM(78~152BPM范围)和81±6mmHg(72~91mmHg范围)。猴椅抑制和静脉注射生理盐水使HR和BP分别增加到233±11BPM和124±11mmHg(在猴椅30分钟期间)。随后的3、6和22HPD时,HR分别增加到232±16、231±14、228±23BPM,平均血压分别增加到123±13、124±12、124±14mmHg。每次动物受到限制时,HR和BP值升高。取自485份被禁食且被固定在猴椅的动物,通常不进行其他血液取样或其他过程。发现97.5%的样品具有<0.03ng/ml的值,只有12个样品具有≥0.03ng/ml的cTnI值,范围为0.03~0.14ng/ml。
 
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