非人灵长类动物（NHP）精液样本采集有多种目的，包括生殖研究、物种保护、传染病研究以及在药物开发过程中评估生殖安全性。在生物医药研究中最常见的精液采集方法是电刺激和阴茎振动刺激。电刺激是利用电流刺激NHP动物产生射精的过程。最常用的电刺激方法是直肠探针电刺激法（RPE）和阴茎电刺激法（PEP）。据报道，直肠探针电刺激产生的样品精子浓度低于阴茎电刺激。因此，它通常被认为不太适合于精液样本的定量评价，而用于定性分析。阴茎电刺激最常用于收集精子进行定量分析，例如，测定精子数量和/或浓度，因为该方法采集到的精液量较大。而对于小型非人灵长类动物（如松鼠猴和狨猴），阴茎振动刺激法（PVS）是比电刺激法更优的采精方法，因为它更适合这些动物的生理特点，同时对动物的福利影响较小。

直肠探针电刺激法（RPE）

描述：这是较早使用的NHP采精方法。通过直接刺激盆腔器官周围的神经肌肉，导致盆腔器官收缩和放松，从而排出内容物。该过程需要对动物进行轻度麻醉，但不需要对动物进行训练。操作者的技术和培训对程序的成功至关重要。

操作步骤：动物被轻度麻醉后侧卧或在保定架上俯卧，使用合适大小的探针，在插入探针前，电极需轻磨、冲洗和消毒。阴茎被轻轻拉出并清洁（可用无菌生理盐水），然后在探针上涂上一层薄薄的水溶性润滑凝胶。探针电极需对准前列腺，为了确保电极与前列腺接触，可将探头的另一端抬起，轻轻向下按压探头的尖端。通过逐渐增加电压直到动物出现腿部伸展等反应，确定动物的电压设定点。达到反应点后，电压保持不变一段时间（最多约5秒），然后逐渐降低。这种电压的逐步增加、保持和降低构成了一个完整的刺激周期。通过多次刺激，通常三组刺激可以产生射精。在整个刺激过程中，阴茎的尖端需要保持在预热的玻璃烧杯或其他收集容器上方。

适用场景：由于这个方法产生的样本精子浓度较低，因此更适合用于定性分析，如检测精液中精子的存在以确认性成熟，以及评估精子细胞的形态。

阴茎电刺激法（PEP）

描述：该方法通过刺激阴茎中的传入神经末梢，随后将刺激传递到与阴茎勃起和射精相关的传出神经通路。该方法在动物清醒状态下采集，传统的保定方式是使用猴杆或者颈圈将动物固定在开放式的猴椅上，但近期有研究表明使用封闭箱椅（closed box chair）是一种更优化的保定方式，可以训练动物直接从笼子进入封闭箱椅内，对动物福利、精液质量都有显著改善。PEP已被证明能够更好地刺激整个生殖道，并且由于无需麻醉，减少了尿液污染和精液样本稀释的问题。此外，与直肠探针法相关的逆行射精（精液进入膀胱）的风险在阴茎电刺激法中被最小化。这种非侵入性技术确实需要对动物进行训练，并且需要控制实验环境（例如安静的房间、熟悉动物的工作人员）。与直肠探针电刺激技术相比，这种方法可能需要更长的时间来获取样本，但通常不会超过几分钟。阴茎电刺激法的一个潜在缺点是，有些动物对阴茎刺激没有反应，因此无法提供精液样本。

操作步骤：将阴茎轻轻拉出，用润滑凝胶包裹的除颤器垫包裹阴茎，将电极连接到电刺激器设备上。从低电压开始刺激（根据动物的品种和体格）不超过15秒，逐渐增加到预设的最大值。每次刺激时，观察动物的生理反应和射精，整个过程通常不超过3次刺激。不同品种的电压刺激相差较大，对于食蟹猴而言，可以从10-30伏特开始，如果需要，可以以 5-10 伏特的增量逐步增加，最高至约50 伏特。在刺激过程中将收集管放在阴茎尖端以收集射精的精液样本。

适用场景：该方法适用于需要较高精子数量和质量的场景，如体外受精（IVF）或单精子卵胞浆内注射（ICSI），因为其能获得更高的精液量和精子浓度。

阴茎振动刺激法（PVS）

描述：该方法利用自然反射，产生正常的射精反应，从而获得自然射精。使用经过改装的振动设备，并配备收集容器。该方法通常将清醒的动物保定在猴椅上，并在黑暗的房间中进行，避免动物过于激动。

操作步骤：将阴茎轻轻从包皮鞘中拉出，将振动玻璃管放在阴茎尖端并保持接触。根据动物对刺激的反应逐渐调整振动参数，并在刺激期间提供休息时间。如果在15-20分钟内未达到射精，则停止刺激。

适用场景：在小型非人灵长类动物（如松鼠猴和狨猴）中，PVS是首选方法，因为这些动物体型较小，直接放置电极进行阴茎刺激较为困难，且直肠探针法在这些小型NHP物种中也不太适用，较小的生殖道和消化道结构可能无法让直肠探针精准放置。

同时，对松鼠猴和狨猴的研究发现，与 RPE 采集的样本相比，振动刺激采集的精液样本中精子和附属腺的产生显著增加。PVS 可产生质量更高的射精，结合了不需要镇静或轻度麻醉的优点，几乎不引起不适，并产生无污染的自然射精。

无论采用何种精液采集方法，均应慎重考虑采精动物的选择。确认精子发生（通过检测精液中的精子）是确认 NHP 性成熟的最可靠方法。在一些 NHP 种属中，精液采集时间应考虑季节性。在此类确认之前，可通过应用常规选择标准（如年龄、体重和/或睾丸体积）优化动物的选择。睾酮由于其脉冲式/昼夜节律性波动和动物间个体差异较大，并不是可靠判定性成熟的指标。

性成熟的具体标准还取决于动物的种属甚至地理来源。例如，来自毛里求斯的食蟹猴已被证实从 3-4 岁开始性成熟（精液中的精子），而来自亚洲大陆的食蟹猴需要额外一年（> 4 岁）才能达到性成熟。关于食蟹猴和恒河猴的文献表明，小于4岁和体重小于4kg的动物不太可能性成熟。

精液采集操作的福利考量

在精液采集时，也应关注动物福利的问题，比如直肠探针电刺激法（RPE）比其他采精技术更具侵入性，因为该方法需要将探针插入动物的直肠，直接刺激前列腺和盆腔器官，可能会对动物造成一定的不适或潜在的生理损伤。因此在进行直肠探针电刺激前，应仔细检查直肠是否存在异常，如瘢痕、狭窄或痔疮。操作者需要密切监控动物的反应和身体状况，定期检查是否有出血或组织损伤的迹象。一旦发现异常，应立即停止操作并给予动物恢复的时间。同时，提供必要的操作后护理和采精频率的限制也是确保动物福利的重要措施。

而阴茎电刺激和阴茎震动刺激法虽然无创，动物也是无需麻醉在猴椅或者封闭箱椅中操作，因此操作过程中应关注的是对动物进行驯化和保定适应，减少动物的应激。同时在电刺激时应严格控制给予刺激的电流，以及电刺激的次数。

通过上文描述，可以看出选择合适的动物以及合适的方法才能够采集到合适的样本，同时应关注动物的福利问题，最大程度减少对动物的不利影响。